Pengembangan Media Kultur Sel Suspensi HEK293, Alur Kerja Optimalisasi Transfeksi Transien, dan Analisis untuk Produksi Batch rAAV

ABSTRAK
Vektor virus adeno terkait rekombinan (rAAV) telah menjadi wahana pengiriman yang populer untuk terapi gen in vivo, tetapi permintaan untuk rAAV terus melampaui pasokan. Proses platform untuk produksi rAAV sedang dikembangkan oleh banyak produsen, dan transfeksi kimiawi sementara dari sel ginjal embrionik manusia 293 (HEK293) saat ini merupakan pendekatan yang paling populer. Namun, sifat mutakhir dari pengembangan proses rAAV mendorong produsen untuk merahasiakan formulasi media kultur sel, urutan plasmid, dan detail lainnya, yang menciptakan rintangan bagi perusahaan kecil dan laboratorium akademis yang ingin berinovasi di bidang ini. Untuk mengatasi masalah ini, kami memanfaatkan sumber daya konsorsium akademis-industri (Advanced Mammalian Biomanufacturing Innovation Center, AMBIC) untuk mengembangkan sistem produksi rAAV berdasarkan transfeksi sementara sel suspensi HEK293 yang diadaptasi ke media internal yang ditentukan secara kimiawi. Kami menemukan bahwa menyeimbangkan kadar zat besi dan kalsium dalam media sangat penting untuk menjaga efisiensi transfeksi dan meminimalkan agregasi sel. Pendekatan rancangan eksperimen digunakan untuk mengoptimalkan proses transfeksi transien untuk produksi rAAV batch, dan rasio PEI:DNA dan kepadatan sel pada transfeksi adalah parameter dengan efek terkuat pada titer genom vektor (VG). Ketika proses transien yang dioptimalkan ditransfer antara dua lokasi universitas, titer VG berada dalam kisaran dua kali lipat. Karakterisasi analitis menunjukkan bahwa rAAV yang dimurnikan dari proses AMBIC memiliki berat molekul protein virus yang sebanding dengan vektor yang berasal dari proses komersial, tetapi perbedaan dalam titer unit transduksi (TU) diamati antara persiapan vektor. Formulasi media yang dikembangkan, proses transfeksi transien, dan analitik untuk titer VG, identitas kapsid, dan titer TU merupakan serangkaian alur kerja yang dapat diadopsi oleh orang lain untuk mempelajari masalah mendasar yang dapat meningkatkan hasil dan kualitas produk di bidang manufaktur rAAV yang baru lahir.

1 Pendahuluan
Vektor virus adeno-associated (AAV) digunakan dalam hampir setengah dari uji klinis terapi gen virus karena tropisme jaringan bergantung serotipe yang luas, nonpatogenisitas, dan imunogenisitas yang rendah dibandingkan dengan vektor virus lainnya (Au et al. 2022 ; Chancellor et al. 2023 ). Enam terapi AAV rekombinan (rAAV) telah disetujui oleh badan pengatur (Alomari 2023 ; Chancellor et al. 2023 ), dan ratusan uji klinis untuk produk rAAV sedang berlangsung (Shen et al. 2022 ; Zhao et al. 2022 ). Namun, proses manufaktur saat ini tidak dapat memenuhi permintaan untuk terapi rAAV yang semakin banyak, karena sistem produksi rAAV yang ada menghasilkan dosis yang jauh lebih sedikit per batch daripada proses yang mapan untuk produksi antibodi (Wright 2022 ).

Platform yang paling umum digunakan untuk memproduksi vektor rAAV adalah transfeksi transien sel ginjal embrionik manusia 293 (HEK293) (Ayuso et al. 2010 ; Fu et al. 2023b ; Ou et al. 2024 ). Dalam sistem ini, sekuens DNA yang diperlukan untuk produksi rAAV, replikasi AAV ( rep ) dan gen kapsid ( cap ), gen pembantu adenovirus, dan kaset gen terapeutik yang diapit oleh pengulangan terminal terbalik (ITR) AAV asli, dipasok melalui tiga plasmid. Platform ini dapat beradaptasi dengan pembuatan terapi yang berbeda dengan mengubah sekuens DNA plasmid yang mengkode kapsid dan genom terapeutik, dan dapat disiapkan di fasilitas baru setelah pengadaan media kultur sel, garis sel inang, dan DNA plasmid (Coplan et al. 2024 ; Zhao et al. 2020 ). Namun, sifat variabel dari transfeksi sementara yang diperparah dengan perbedaan antara formulasi media, host HEK293, dan urutan plasmid antar platform telah menyulitkan bidang ini untuk menetapkan proses hulu yang konsisten dan berproduksi tinggi. Perbandingan antarproses juga menjadi rumit karena perbedaan metode yang digunakan untuk mengukur genom rAAV, kapsid, dan titer fungsional (François et al. 2018 ; Fu et al. 2019 ; Gimpel et al. 2021 ; Kontogiannis et al. 2024 ; Wang et al. 2020 ).

Formulasi media kultur sel yang kuat merupakan langkah awal yang penting dalam membangun platform produksi protein terapeutik karena menentukan seberapa efektif sel dapat tumbuh dan menghasilkan protein yang diinginkan. Media harus bebas dari serum atau komponen hewani demi alasan keamanan dan reproduktifitas, tetapi bahan-bahan yang tepat yang dibutuhkan dalam formulasi yang ditentukan secara kimia bergantung pada lini sel dan produk (Ou et al. 2024 ; Petiot et al. 2015 ). Kemajuan telah dibuat untuk mengidentifikasi komponen lipid yang merupakan pengganti yang cukup untuk serum (Miki dan Takagi 2015 ; Rodrigues et al. 2011 ) dan menentukan kelompok bahan tambahan yang diperlukan untuk mempertahankan kultur sel mamalia termasuk asam amino, vitamin, dan logam jejak (Chaderjian et al. 2008 ; Kim et al. 2005 ; Shen et al. 2010 ; Takagi et al. 2017 ). Namun, formulasi media komersial sering kali bersifat hak milik, sehingga menjadi tantangan bagi perusahaan kecil dan akademisi untuk memilih bahan untuk studi optimasi (Cordova et al. 2023 ). Akibatnya, banyak laporan yang diterbitkan yang menyelidiki bagaimana formulasi media memengaruhi kinerja kultur HEK293 telah dilakukan dengan komponen yang berasal dari non-kimia seperti serum dan pepton, mempelajari efek komponen tunggal tanpa mengetahui kadar dasarnya, atau memberikan perbandingan buta dari media atau umpan komersial yang memiliki hak milik (Celebi et al. 2022 ; Liste-Calleja et al. 2014 ; Ou et al. 2024 ; Petiot et al. 2015 ; Shen et al. 2010 ). Beberapa pemasok sekarang menawarkan layanan optimasi panel media untuk menemukan media yang ditentukan secara kimia terbaik untuk lini sel pelanggan (Martin dan Zatina 2021 ), tetapi pendekatan ini mengaburkan informasi yang diperlukan bagi peneliti untuk secara sistematis mengeksplorasi penyesuaian formulasi baru. Identifikasi kelompok inti bahan yang mendukung pertumbuhan sel yang kuat, efisiensi transfeksi sementara, dan hasil rAAV akan membantu lebih banyak organisasi membangun proses yang relevan secara industri.

Proses transfeksi dasar dapat ditetapkan untuk penyaringan media, tetapi lebih menguntungkan untuk mengoptimalkan parameter transfeksi transien rAAV setelah formulasi media akhir dipilih. Variabel kontinu seperti kepadatan sel yang hidup (VCD) pada transfeksi dan parameter untuk kompleksasi DNA plasmid telah dipelajari paling sering, dan ada laporan yang menyelidiki variabel diskrit seperti pilihan garis sel inang, media, atau reagen transfeksi (Chen et al. 2024 ; Coplan et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ; Grieger et al. 2016 ; Gu et al. 2018 ; Guan et al. 2022 ; Zhao et al. 2020 ). Optimasi parameter proses berkelanjutan seperti rasio plasmid sering dilakukan menggunakan pendekatan desain eksperimen bertingkat (DOE) yang pertama-tama mengidentifikasi parameter berdampak tinggi dan kemudian menyempurnakan rentangnya untuk memaksimalkan titer dan menyempurnakan atribut kualitas produk lainnya (Mandenius dan Brundin 2008 ; Politis et al. 2017 ). Pendekatan ini telah berhasil digunakan untuk optimasi proses batch transfeksi rangkap tiga yang dimediasi PEI dan telah memungkinkan peningkatan titer genom vektor (VG) 1,2 hingga 17 kali lipat tergantung pada serotipe rAAV dan platform produksi (Coplan et al. 2024 ; Zhao et al. 2020 ). Pendekatan pemodelan mekanistik juga telah diterapkan untuk mengoptimalkan produksi rAAV. Studi-studi ini telah menunjukkan bahwa waktu offset ekspresi rep dan cap berkontribusi terhadap persentase kapsid kosong yang tinggi dalam kultur batch yang ditransfeksi sementara, yang mengungkapkan parameter proses hulu tambahan yang perlu dioptimalkan (Nguyen et al. 2021 ; Nguyen et al. 2024 ; Srinivasan et al. 2024 ).

Pemilihan mode kultur juga penting saat memilih alur kerja untuk pengoptimalan proses. Sebagian besar penelitian yang diterbitkan hingga saat ini menggunakan kultur batch yang tumbuh dalam tabung goyang atau bioreaktor sebagai sistem dasar untuk pengoptimalan transfeksi transien (Chen et al. 2024 ; Coplan et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ; Grieger et al. 2016 ; Gu et al. 2018 ; Guan et al. 2022 ; Zhao et al. 2020 ), tetapi beberapa penelitian terbaru telah menggunakan kultur perfusi (Deng et al. 2025 ; Mendes et al. 2022 ; Nguyen et al. 2024 ; Park et al. 2024a ). Sementara beberapa alur kerja kultur batch yang dipublikasikan menggunakan pertukaran media atau langkah top off pasca-transfeksi (Grieger et al. 2016 ; Guan et al. 2022 ) dan umpan yang mengandung glukosa atau natrium butirat (Coplan et al. 2024 ; Zhao et al. 2020 ), semua sistem kultur sel ini memiliki satu langkah transfeksi diikuti oleh ~72 jam produksi rAAV sebelum panen. Durasi kultur batch yang relatif singkat memungkinkan penyaringan parameter transfeksi, kondisi kultur, dan media kultur yang efisien, tetapi VCD maksimum yang dicapai oleh sistem ini terbatas. Mengkultur sel dalam perfusi memungkinkan pengenalan nutrisi segar selama produksi rAAV, selanjutnya memperpanjang durasi batch dan meningkatkan VCD maksimum yang dicapai. Titer VG rAAV telah terbukti meningkat hingga 3,4 kali lipat dalam kultur perfusi dibandingkan kultur batch (Deng et al. 2025 ; Mendes et al. 2022 ; Nguyen et al. 2024 ; Park et al. 2024a ). Menariknya, beberapa peningkatan VG ini telah dicapai setelah beberapa transfeksi dilakukan selama periode kultur hingga 15 hari (Nguyen et al. 2024 ). Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa sementara banyak parameter transfeksi yang sama harus dioptimalkan untuk proses perfusi dan batch, ada perbedaan yang jelas dalam bagaimana parameter untuk kultur sel dan parameter media harus dioptimalkan untuk setiap format kultur. Sementara semua studi kultur batch dan perfusi yang disebutkan di atas telah memberikan informasi berharga mengenai kerangka kerja pengoptimalan proses, mereka dapat sulit untuk menarik kesimpulan umum karena media kultur dan sel yang digunakan telah menjadi hak milik.

Kemampuan untuk menginterpretasikan hasil studi proses dan pengembangan media juga bergantung pada ketahanan metode karakterisasi analitis. Banyak studi optimasi yang dipublikasikan menggunakan titer VG sebagai keluaran utama atau satu-satunya untuk membandingkan kondisi karena merupakan metrik penentu dosis untuk rAAV dan mudah diukur dengan reaksi berantai polimerase kuantitatif atau digital (qPCR atau dPCR) (Chen et al. 2024 ; Grieger et al. 2016 ; Gu et al. 2018 ; Guan et al. 2022 ). Uji tetesan digital (ddPCR) dan qPCR juga telah digunakan dalam format multipleks untuk mempelajari integritas genom guna memantau kadar populasi kapsid penuh versus sebagian penuh (Eisenhut et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ; Furuta-Hanawa et al. 2019 ; Zanker et al. 2022 ). Selain itu, karakterisasi populasi kapsid rAAV untuk atribut termasuk titer kapsid total (Leibiger et al. 2024b ), rasio penuh/kosong (Heldt et al. 2023 ; Suk Lee et al. 2024 ; Wagner et al. 2023 ), dan rasio protein kapsid (VP) (Onishi et al. 2023 ) sangat penting untuk mengevaluasi kinerja proses selama studi pengembangan. Analisis titer fungsional vektor dengan transduksi penting tetapi lebih kompleks, karena memerlukan pemilihan sistem in vitro yang permisif dan teknik analisis genom atau protein terapeutik dengan rentang deteksi yang memadai (Green dan Lee 2021 ; Wright 2020 ). Metode yang berdasarkan deteksi DNA seperti uji standar emas TCID 50 sudah lebih mapan (Duong et al. 2023 ), tetapi mengukur ekspresi protein sebagai keluaran uji titer fungsional merupakan indikator yang lebih langsung dari kemanjuran produk dibandingkan mengukur genom yang ditransfer ke sel target (François et al. 2018 ; McColl-Carboni et al. 2024 ). Mengembangkan uji berbasis ekspresi protein yang dapat beradaptasi untuk berbagai transgen dan tidak memerlukan peralatan mahal akan membantu pengembang produk dalam menetapkan tolok ukur titer unit transduksi (TU) untuk platform manufaktur mereka.

Dalam studi ini, kami mengembangkan platform hulu untuk produksi batch rAAV menggunakan suspensi sel HEK293 yang mudah diperoleh yang diadaptasi ke dalam medium yang ditentukan secara kimia dengan formulasi yang dikembangkan secara internal. rAAV diproduksi menggunakan proses transfeksi transien yang dioptimalkan berdasarkan transfer DNA plasmid yang dimediasi PEI, dan vektor dikarakterisasi oleh qPCR untuk titer VG, ddPCR untuk integritas genom, kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS) untuk identitas kapsid, dan transduksi in-vitro yang digabungkan dengan flow cytometry untuk titer TU. Pengembangan media, proses, dan analitik dilakukan di tiga universitas yang berbeda, dan sumber daya dari Advanced Mammalian Biomanufacturing Innovation Center (AMBIC), sebuah pusat penelitian kooperatif industri-universitas (IUCRC), dimanfaatkan selama proyek berlangsung. Kami menemukan bahwa menyeimbangkan kadar zat besi dan kalsium dalam medium sangat penting untuk menjaga efisiensi transfeksi dan meminimalkan agregasi sel. Parameter transfeksi sementara dengan dampak tertinggi pada titer VG adalah rasio PEI:DNA dan kepadatan sel pada saat transfeksi. rAAV yang dimurnikan dari proses AMBIC (internal) memiliki protein kapsid virus dengan massa molekul yang sebanding dengan vektor yang berasal dari proses komersial, tetapi perbedaan titer TU diamati antara persiapan vektor. Sistem yang dikembangkan termasuk media, proses, dan analitik dapat diadopsi oleh orang lain untuk mempelajari bagaimana peningkatan dapat dilakukan pada proses pembuatan rAAV.

2 Bahan dan Metode
2.1 Persiapan Plasmid
Plasmid yang dibutuhkan untuk transfeksi rAAV transien rangkap tiga, pAdDeltaF6 (pHelper; Addgene 112867—hadiah dari James Wilson), pAAV2/2 (pRepCap; Addgene 104963—hadiah dari Melina Fan), dan pAAV-CMV-GFP (pGOI; Addgene 67634—hadiah dari Connie Cepko; Xiong et al. 2015 ), dibeli dari Addgene. Plasmid pembawa Escherichia coli ditumbuhkan dalam kaldu Luria-Bertani yang dilengkapi dengan 100 µg/mL ampisilin atau karbenisilin dan sel dipanen untuk persiapan plasmid. Plasmid diekstraksi dan dimurnikan dengan ZymoPURE II Plasmid Maxiprep Kit (Zymo Research) atau EndoFree Gigaprep kit (Qiagen) dan konsentrasi DNA akhir diukur dengan absorbansi A260 pada Nanodrop OneC (ThermoFisher) atau DS-11 FX+ (DeNovix).

2.2 Kultur Sel
Sel HEK293 (ATCC 1573.3) yang diadaptasi ke media BalanCD HEK293 (BalanCD; Irvine Scientific), AMBIC 1.1 (Millipore Sigma), atau AMBIC 1.293 (Millipore Sigma) yang disuplemen dengan GlutaMax 4 mM (ThermoFisher), sel yang diadaptasi dari suspensi HEK293 (Mass Biologics) dalam media BalanCD dengan GlutaMax 4 mM, dan sel Expi293F (ThermoFisher A14527) dalam media Expi293 (ThermoFisher) dikultur dalam labu kocok beralas datar 125 mL. Sel dikultur dalam volume kerja 20–30 mL dan disalurkan ke 0,2 × 106 –0,5 × 106 sel/mL setiap 3–4 hari berdasarkan hitungan yang diambil menggunakan pengecualian biru tripan. Rincian metode kultur dan penghitungan sel yang digunakan selama setiap tahap pengembangan proses tercantum dalam Informasi Pendukung S1: Tabel S1 . Sel HEK293, HEK293, dan Expi293 masing-masing digunakan dalam proses internal, sistem komersial dasar untuk pengembangan proses, dan proses komersial untuk pembuatan standar internal analitis.

2.3 Adaptasi HEK293 ke AMBIC 1.1 Medium
Sel HEK293 dicairkan dalam medium BalanCD dan dikultur selama dua kali pasase selama 3 hari. Sel kemudian menjalani dua pasase selama 3 hari dalam campuran medium 75%–25% v/v (BalanCD-AMBIC 1.1). Sel kemudian dikultur dalam campuran 50%–50% v/v selama dua pasase selama 3 hari, diikuti dengan pasase lanjutan dalam medium 100% AMBIC 1.1. Sel disimpan dalam medium AMBIC 1.1 dengan 10% dimetil sulfoksida (DMSO) untuk digunakan dalam percobaan berikutnya.

2.4 Reformulasi AMBIC 1.1 untuk Pertumbuhan dan Transfeksi HEK293
Media AMBIC 1.1 (IA 87093 C), yang merupakan versi suntingan dari AMBIC 1.0 yang sebelumnya dikembangkan dan dipublikasikan untuk kultur CHO (Cordova et al. 2023 ) diproduksi oleh layanan media kustom volume kecil imMEDIAte ADVANTAGE® milik Millipore Sigma. Untuk memastikan kelarutan, Ferric Ammonium Citrate digunakan dalam AMBIC 1.1 sebagai pengganti Ferrous Sulfate yang digunakan dalam AMBIC 1.0. Perubahan lainnya yang dilakukan pada AMBIC 1.0 untuk merumuskan AMBIC 1.1 meliputi penggabungan sumber nutrisi, terutama logam jejak. Sumber vanadium, selenium, seng, magnesium, asparagin, dan tokoferol diubah menjadi garam sumber tunggal daripada beberapa garam untuk nutrisi utama. Daftar semua nutrisi yang dihapus dari AMBIC 1.0 tersedia dalam Informasi Pendukung S1: File S2 , beserta nomor CAS-nya.

Layanan yang sama digunakan untuk produksi “AMBIC 1.1-Deleted,” suatu formulasi dasar tanpa kalsium klorida, kalsium pantotenat, besi(III) sitrat, dan natrium sitrat yang digunakan selama pengembangan media HEK293. AMBIC 1.1-Deleted dicampur dengan larutan stok komponen yang dihilangkan dan bahan-bahan lain yang menarik selama studi pengoptimalan media. Larutan stok kalsium klorida 100 mM (C4901-500G, Sigma Aldrich), kalsium pantotenat 100 mM (P022-100GM, Caisson Labs), dan natrium klorida 100 mM (S5886-500G, Sigma-Aldrich) digunakan selama pengembangan AMBIC 1.293A, versi terbaru dari media AMBIC 1.1-Deleted yang dilengkapi dengan kalsium pada tingkat yang dioptimalkan untuk pertumbuhan HEK293. Larutan 110 mM besi(III) EDTA (EDFS-100G, Sigma Aldrich) dan 0,5 M EDTA (E0307, ​​Teknova) digunakan dalam studi spiking untuk mengembangkan formulasi akhir AMBIC 1.293. Semua formulasi media yang diuji selama pengembangan dilengkapi dengan 4 mM GlutaMax (ThermoFisher). Osmolaritas formulasi media diukur menggunakan Osmometer Sampel Tunggal 3250 (Advanced Instruments). Sel HEK293 dikultur selama ≥ 3 lintasan dalam formulasi media baru sebelum eksperimen efisiensi transfeksi dilakukan. Selama setiap lintasan, sel disemai pada 0,5 × 106 sel /mL dan dikultur selama 3–4 hari.

2.5 Desain DOE dan Model Fitting
Desain DOE dan model yang sesuai untuk studi penyaringan DOE (sDOE) dan optimasi DOE (opDOE) dilakukan di MODDE® (V13.0, Sartorius, Swedia). Analisis kuadrat terkecil parsial (PLS) digunakan untuk memperkirakan suku koefisien dalam model, dan transformasi logaritmik dari set data respons dilakukan sebagaimana diperlukan untuk memastikan semua distribusi data respons normal untuk meningkatkan kemampuan prediktif. Suku model yang tidak signifikan ( p  > 0,05) kemudian dihilangkan menggunakan fungsi penyetel otomatis MODDE® hingga tidak ada lagi peningkatan lebih lanjut dalam kecocokan model yang diamati. Titik setel optimal untuk sDOE dan opDOE ditentukan dengan melakukan optimasi target untuk memaksimalkan titer VG dan efisiensi transfeksi. Batas penerimaan ditetapkan pada probabilitas kegagalan 1%, resolusi ditetapkan pada 16 blok diskrit, dan 50.000 simulasi dilakukan di setiap blok per respons.

2.6 Transfeksi untuk Ekspresi eGFP atau Produksi rAAV2-eGFP
Sel HEK293 ditransfeksi secara kimia setelah ≥ 3 kali pasase dalam medium kultur masing-masing untuk mengekspresikan protein fluoresensi hijau yang ditingkatkan (eGFP) selama studi pengembangan media atau untuk memproduksi rAAV2-eGFP. Parameter transfeksi terperinci yang digunakan selama pengembangan media di Situs A, optimasi proses internal di Situs B, transfer proses internal di Situs C, dan produksi material referensi rAAV menggunakan proses komersial di Situs C tercantum dalam Informasi Pendukung S1: Tabel S2 . Secara singkat: reagen transfeksi kimia ditambahkan ke DNA plasmid yang telah diencerkan sebelumnya dalam medium kompleksasi, kompleks reagen-DNA dibentuk selama langkah inkubasi berikutnya, dan kompleks ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu yang kemudian dikultur selama 3 hari. Tiga transfeksi plasmid digunakan untuk memproduksi rAAV menggunakan pRepCap, pGOI, dan pHelper di semua situs. eGFP diekspresikan selama pengembangan media di Situs A dengan hanya pGOI yang ditambahkan ke massa DNA total yang sama seperti ketiga plasmid yang digunakan untuk produksi rAAV. Jumlah sel diambil setiap hari menggunakan pengecualian biru tripan dan efisiensi transfeksi diukur dengan mikroskopi atau flow cytometry. Setelah penghentian produksi rAAV, kultur dipanen dengan lisis kimia (Situs A) atau mekanis (Situs B, Situs C). Langkah-langkah panen terperinci yang digunakan selama setiap tahap pengembangan platform tercantum dalam Informasi Pendukung S1: Tabel S3 .

2.7 Pengukuran Titer VG rAAV dengan qPCR
Sampel lisat rAAV diperlakukan dengan DNaseI untuk menghilangkan DNA residual dan kemudian proteinase K untuk pencernaan kapsid guna melepaskan VG sebelum analisis qPCR (Informasi Pendukung S1: Tabel S4 ). Sampel kemudian diencerkan dalam air kelas biologi molekuler untuk qPCR. Ketika kurva standar dibuat dari bahan referensi rAAV, sampel vektor diperlakukan secara identik dengan sampel lisat. Jika DNA plasmid (pDNA) digunakan untuk pembuatan kurva standar, pDNA yang dilinearisasi atau superkoil diencerkan secara serial dalam air kelas biologi molekuler. Primer yang digunakan untuk qPCR menargetkan transgen eGFP. Analisis regresi untuk plot siklus konsentrasi standar versus kuantifikasi log 10 (Cq) dilakukan untuk menghasilkan kurva standar, dan persamaan regresi kemudian digunakan untuk menentukan salinan rAAV per sampel.

2.8 Analisis Integritas Genom Tiga Dimensi rAAV dengan ddPCR
Sampel lisat rAAV diproses dengan protokol Site C untuk pencernaan DNaseI dan pengobatan proteinase K (Informasi Pendukung S1: Tabel S4 ). Sampel diencerkan dalam air kelas biologi molekuler sebelum analisis ddPCR sehingga reaksi mengandung kurang dari 4000 droplet positif untuk meminimalkan fraksinasi beberapa genom per droplet (Zanker et al. 2022 ). ddPCR multipleks dilakukan pada sistem QX ONE (Bio-Rad) menggunakan 2x ddPCR Supermix untuk Probe tanpa dUTP (Bio-Rad). Reaksi disiapkan dengan primer 900 nM, probe 250 nM, dan sampel rAAV yang diencerkan 3 µL dan dijalankan menggunakan protokol kuantifikasi langsung (DQ) default dengan pengecualian mengubah suhu annealing primer menjadi 55°C. Pengujian primer/probe menargetkan promotor cytomegalovirus (CMV), eGFP, dan ekor poliadenilasi β-globin manusia (ekor polyA) dengan pengujian probe PrimeTime qPCR yang masing-masing berisi probe Cy5, FAM, dan HEX (Informasi Pendukung S1: Tabel S5 ).

2.9 Pemurnian rAAV2-eGFP untuk Karakterisasi Analitik
Pemurnian kapsid rAAV2 dilakukan menggunakan resin afinitas Capto™ AVB (Cytiva) dengan kolom Tricorn 5/50 (Cytiva) (volume kolom 1 mL) dan sistem kromatografi AKTA™ Pure (Cytiva). Ekuilibrasi dilakukan dengan 20 volume kolom (CV) buffer ekuilibrasi (20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,5). Sebanyak 50 mL lisat kultur sel yang dijernihkan dan disaring 0,22 µM kemudian dimasukkan, kolom dicuci dengan 10 CV buffer ekuilibrasi, dan rAAV2 dielusi dengan 20 CV buffer elusi (0,1 M Glycine-HCl, pH 2,6). Semua langkah dilakukan pada laju alir 1 mL/menit. Netralisasi kolam elusi segera dilakukan dengan penambahan 10% v/v Tris-HCl 1 M, pH 8,7. Kolam elusi diukur untuk titer VG menggunakan metode qPCR Site C (Informasi Pendukung S1: Tabel S4 ) dan dipekatkan menggunakan filter putar Amicon Ultra-15 dengan batas 10 kilodalton (Millipore Sigma).

2.10 Analisis Identitas Protein Kapsid Utuh dengan LC-MS
Sebanyak 1,5 × 10 11 VG rAAV2-eGFP diperlakukan dengan asam asetat 10% v/v selama 15 menit, lalu disentrifugasi pada 16.260 g selama 5 menit (Jin et al. 2017 ; Zhang et al. 2021 ). LC-MS dilakukan menggunakan instrumen Waters BioAccord dengan ACQUITY Premier dan kolom Agilent ZORBAX RRHD 300 Å StableBond C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm). Parameter metode dirangkum dalam Informasi Pendukung S1: Tabel S6 . Urutan FASTA dari UniProt (uniprot.org) yang terkait dengan protein AAV2 VP1, VP2, dan VP3 ditetapkan dalam metode analisis.

2.11 Titer TU dengan Transduksi In Vitro dan Flow Cytometry
Sebanyak 500 µL sel HEK293s (ATCC 1573.3) yang disemai pada 0,3 × 106 sel /mL dalam medium AMBIC 1.293 dialiquot ke dalam setiap sumur pelat sumur dalam 96 (96 DWP; Biotix) untuk menyemai 150.000 sel per sumur. Stok vektor rAAV2-eGFP yang dimurnikan yang diproduksi dengan proses internal, diproduksi secara internal dengan sistem Expi293 (komersial), atau dibeli dari Addgene (Addgene # 105530-AAV2) diencerkan dan ditambahkan ke kultur DWP dalam rangkap tiga pada delapan multiplisitas infeksi (MOI) yang berkisar dari 15 hingga 65.000 VG/sel berdasarkan titrasi qPCR dengan protokol Site C. Kontrol yang tidak ditransduksi dikultur secara paralel. Sel diinkubasi pada suhu 37°C, 350 rpm (kecepatan 25 mm), 5% CO 2 , dan kelembaban relatif 80% selama 72 jam sebelum sampel diambil untuk analisis flow cytometry.

Data flow cytometry diperoleh pada Accuri C6 Plus flow cytometer (BD) yang dilengkapi untuk mendeteksi eGFP (laser 488 nm, emisi 510/15). Skema gating untuk mengisolasi sel eGFP+ ditetapkan menggunakan sel host HEK293 yang tidak ditransduksi (Informasi Pendukung S1: Gambar S1 ). Analisis data untuk ≥ 10.000 kejadian sel tunggal per sumur dilakukan menggunakan Perangkat Lunak BD CSampler™ Plus v1.0.27.1 dan Python v3.9.17 dengan FlowKit v1.0.1. Rasio VG terhadap unit transduksi (rasio VG/TU) dihitung dengan mengambil kebalikan dari kemiringan di wilayah linier data untuk fraksi sel positif eGFP (eGFP+) (dari 1) versus MOI. Daerah linier untuk setiap persiapan vektor didefinisikan sebagai rentang MOI di mana R2 > 0,95 pada plot fraksi sel  eGFP+ versus MOI dan median fluoresensi sel GFP+ versus MOI bervariasi kurang dari dua kali lipat untuk meminimalkan penyertaan sel yang ditransduksi oleh beberapa rAAV dalam perhitungan rasio VG/TU (Informasi Pendukung S1: Gambar S2 ).

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Penilaian Awal Pertumbuhan dan Transfeksi HEK293 dalam AMBIC 1.1 Sedang
Sel yang disimpan dalam BalanCD, medium kultur sel yang banyak digunakan untuk produksi rAAV, diadaptasi ke AMBIC 1.1, medium kultur sel yang didefinisikan secara kimia. AMBIC 1.1 dan pendahulunya AMBIC 1.0 dikembangkan untuk produksi mAb yang stabil dalam sel CHO suspensi (Cordova et al. 2023 ), dan AMBIC 1.1 digunakan sebagai titik awal untuk definisi medium kultur sel untuk produksi sementara rAAV dalam HEK293. Sepanjang adaptasi dari BalanCD ke AMBIC 1.1, agregasi sel tetap parah dan gumpalan besar > 30 sel diamati (Informasi Pendukung S1: Gambar S3A ). Meskipun pertumbuhan sel lebih lambat dalam AMBIC 1.1 daripada dalam BalanCD, sel-sel tetap hidup, yang memungkinkan kami untuk mencoba transfeksi kimia HEK293 untuk mengekspresikan eGFP. Fluoresensi diamati pada sel yang dikultur dalam BalanCD, tetapi tidak pada sel yang dikultur dalam AMBIC 1.1 (Informasi Pendukung S1: Gambar S4 ).

3.2 Identifikasi Komponen Media Penyebab Agregasi dan Penghambatan Transfeksi
Kami pertama-tama berusaha menentukan penyebab agregasi. Sel dapat beragregasi karena berbagai alasan, termasuk saat beradaptasi dari serum yang mengandung media yang ditentukan secara kimia, melalui adhesi protein permukaan sel yang dimediasi ion, dan karena tekanan geser (Alberts et al. 2002 ; Cruz et al. 1998 ; Zhao et al. 2007 ). Karena sel kami sudah berada di media yang ditentukan secara kimia dan tidak mengalami geser berlebihan dalam kultur labu goyang tanpa sekat, kami menyelidiki apakah adhesi sel adalah penyebab utama penggumpalan sel. Kami memilih untuk memeriksa bagaimana kadar kalsium memengaruhi pertumbuhan sel karena anggota superfamili kadherin telah terbukti meningkat dalam sel suspensi HEK293 (Malm et al. 2020 ), yang dapat menyebabkan kadar kalsium yang tinggi dalam media kultur menginduksi agregasi dan diferensiasi sel (Liu et al. 2010 ; Tu dan Bikle 2013 ; Zhao et al. 2007 ). Analisis transkriptomik telah menunjukkan bahwa gen kadherin 23 meningkat pada sel-sel penghasil tinggi selama produksi rAAV, yang selanjutnya memotivasi perlunya menyetel kadar kalsium dalam media kultur untuk pembuatan vektor (Tworig et al. 2024 ). Sel HEK293 yang tumbuh dalam media BalanCD dengan 110 µM kalsium tidak menggumpal secara signifikan, tetapi peningkatan kadar kalsium hingga 510 µM menekan VCD akhir hingga 75% dan viabilitas hingga 42% selama kultur 6 hari relatif terhadap kondisi basa (Gambar 1A,B ). Menambahkan EGTA ke dalam kultur untuk kelasi kalsium selektif (Feng et al. 2007 ; Neely et al. 1976 ) meminimalkan dampak lonjakan kalsium, yang menyebabkan hanya penurunan VCD akhir sebesar 24% relatif terhadap kultur BalanCD basa (Gambar 1A ) dan meminimalkan pembentukan agregat sel (Informasi Pendukung S1: Gambar S3B ). AMBIC 1.1 mengandung 822 µM kalsium, jadi jelas bahwa kadar kalsium dalam media AMBIC HEK baru perlu dikurangi secara signifikan.

Meskipun agregasi dapat berkontribusi pada penekanan transfeksi, total penghambatan yang diamati saat mentransfeksi HEK293 dalam AMBIC 1.1 (Informasi Pendukung S1: Gambar S4 ) menunjukkan bahwa setidaknya ada satu komponen media penghambat dalam AMBIC 1.1. Kami menaruh minat khusus pada besi(III) sitrat, yang telah terbukti menghambat transfeksi kimia dalam sel CHO (Capella Roca et al. 2020 ; Eberhardy et al. 2009 ) dan hadir pada 130 µM dalam AMBIC 1.1. Efek penghambatan ini dapat dikurangi dengan penambahan EDTA, senyawa yang memiliki afinitas lebih tinggi terhadap besi daripada sitrat (Bertheussen 1993 ; Eberhardy et al. 2009 ). Kami mengamati bahwa penambahan jumlah EDTA yang meningkat hingga 300 µM berkorelasi positif dengan efisiensi transfeksi tetapi memiliki sedikit efek negatif pada viabilitas untuk kultur dalam AMBIC 1.1 (Gambar 2A,B ). Lonjakan EDTA 300 µM memulihkan efisiensi transfeksi menjadi 28%, yang mendekati efisiensi transfeksi 31% yang diamati dalam kondisi kontrol BalanCD (B-) tanpa penambahan EDTA atau besi(III) sitrat (Gambar 2A ). Tampaknya ada batas atas jumlah EDTA yang dapat digunakan untuk menyelamatkan efisiensi transfeksi dalam AMBIC 1.1, karena penambahan 1000 µM EDTA mengurangi efisiensi transfeksi menjadi 5% dan menyebabkan penurunan viabilitas sebesar 40% dibandingkan dengan kondisi EDTA 0 µM AMBIC 1.1 (Gambar 2A,B ). Efek serupa diamati dalam medium BalanCD yang dicampur dengan besi sitrat, karena efisiensi transfeksi sebesar 0% diamati dalam kondisi 130 µM besi sitrat/0 µM EDTA, dan efisiensi transfeksi sebesar 1% diamati dalam kondisi 130 µM besi sitrat/1000 µM EDTA. Selain itu, kultur 130 µM besi sitrat/1000 µM EDTA dalam medium BalanCD mengalami penurunan viabilitas sebesar 50% dibandingkan dengan kondisi 130 µM besi sitrat/0 µM EDTA BalanCD (Gambar 2A,B ). Besi(III) juga telah terbukti menurunkan viabilitas sel HEp-2 yang dikultur pada konsentrasi tinggi (Terpiłowska dan Siwicki 2017 ).

3.3 Pengembangan AMBIC 1.293 Medium
Temuan di atas tentang efek negatif kalsium dan besi sitrat memotivasi formulasi “AMBIC 1.1-Deleted,” medium AMBIC 1.1 yang dimodifikasi yang sama sekali tidak mengandung kalsium klorida (sebelumnya 778 µM), kalsium pantotenat (sebelumnya 22 µM), amonium sitrat besi (sebelumnya 130 µM), dan natrium sitrat (sebelumnya 112 µM). Medium AMBIC 1.1-Deleted digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan formulasi yang cocok untuk pertumbuhan dan transfeksi HEK293. Pertama, garam kalsium ditambahkan ke AMBIC 1.1-Deleted hingga konsentrasi total 110 µM, tingkat yang sama yang ada dalam medium BalanCD (Gorfein et al. 2015 ). Kalsium dipasok oleh campuran kalsium klorida 78 µM dan kalsium pantotenat 22 µM, atau oleh kalsium klorida 110 µM saja. Kurva pertumbuhan dan viabilitas selama empat lintasan untuk campuran kalsium klorida dan pantotenat AMBIC secara umum mengikuti tren untuk media BalanCD (Gambar 3 ). Namun, VCD puncak dan viabilitas menurun untuk kondisi kalsium klorida saja selama lintasan ketiga dan keempat, dengan VCD terminal lintasan 4 dan viabilitas masing-masing 4,1 dan 2,1 kali lipat lebih rendah daripada di akhir lintasan 1 (Gambar 3 ). Kami kemudian merumuskan AMBIC 1.293 A, versi AMBIC 1.1-Deleted yang dimodifikasi kalsium, dengan 78 µM kalsium klorida dan 22 µM kalsium pantotenat. Kebutuhan akan asam pantotenat, prekursor koenzim penting (Schnellbaecher et al. 2019 ), selaras dengan literatur, karena telah terbukti memiliki efek positif pada pertumbuhan sel dan kualitas produk antibodi monoklonal dalam kultur CHO (Gangwar et al. 2021 ; Zhang et al. 2013 ).

Percobaan selanjutnya difokuskan pada penentuan suplementasi zat besi yang tepat untuk mengembangkan medium AMBIC HEK final yang permisif terhadap transfeksi. Tiga garam besi, besi(III) nitrat, besi(III) klorida, dan besi(III) EDTA, diuji kelarutannya pada 113 µM, yang dilakukan untuk menyamakan konsentrasi besi(III) sitrat dalam AMBIC 1.1. Hanya besi(III) EDTA (FeEDTA) yang larut pada 113 µM. Transfeksi eGFP dalam AMBIC 1.293A yang disuplemen dengan 113 µM FeEDTA menunjukkan efisiensi transfeksi < 1%, yang merupakan sedikit peningkatan dibandingkan dengan total penghambatan yang diamati dalam AMBIC 1.1 (Informasi Pendukung S1: Gambar S5 ). Namun, kami menduga bahwa 113 µM FeEDTA masih menyediakan zat besi berlebih, karena efisiensi transfeksi dalam AMBIC 1.293A tanpa zat besi adalah 21,5%, yang mendekati efisiensi transfeksi 22,6% yang diamati dalam BalanCD (Informasi Pendukung S1: Gambar S5 ), tetapi sel tidak tumbuh dengan baik pasca-transfeksi tanpa adanya zat besi.

Setelah memverifikasi bahwa tidak ada perbedaan osmolalitas yang berarti antara media AMBIC 1.1, AMBIC 1.1-Deleted dengan dan tanpa komponen tambahan, AMBIC 1.293A, dan BalanCD (Informasi Pendukung S1: Tabel S7 ) yang dapat memengaruhi efisiensi transfeksi, penyaringan pertumbuhan empat lintasan dilakukan pada kultur yang tumbuh dalam AMBIC 1.293A dengan konsentrasi FeEDTA berkisar antara 15 hingga 113 µM (Informasi Pendukung S1: Gambar S6 ). Kultur yang tumbuh dalam media AMBIC 1.293 A yang mengandung 15, 30, 60, 90, atau 113 µM FeEDTA mencapai VCD yang setara atau lebih tinggi daripada kultur yang tumbuh dalam media BalanCD (Informasi Pendukung S1: Gambar S6A ). Viabilitas kultur BalanCD dan sebagian besar kultur AMBIC 1.293A berfluktuasi dari 90% hingga 100% selama empat lintasan, kecuali kondisi FeEDTA 15 µM yang memiliki viabilitas 88% pada akhir Lintasan 3 (Informasi Pendukung S1: Gambar S6B ).

Formulasi AMBIC 1.293A dengan konsentrasi FeEDTA dasar 30 atau 60 µM dengan spike EDTA 0–14 µM untuk mengkelat kelebihan zat besi kemudian diuji pertumbuhannya selama tiga lintasan dan efisiensi transfeksi selama lintasan ketiga. VCD Lintasan 3 Terminal untuk semua kondisi mendekati atau lebih besar daripada VCD pada akhir Lintasan 1 (Informasi Pendukung S1: Gambar S7A ), dan semua kultur mempertahankan viabilitas 90%–100% selama Lintasan 3 (Informasi Pendukung S1: Gambar S7B ). Namun, efisiensi transfeksi untuk sebagian besar kondisi adalah 0,15 hingga 0,55 kali lipat lebih rendah daripada uji media AMBIC 1.293A bebas zat besi (21,5%), dengan pengecualian kondisi 30–14 (base FeEDTA-Spike EDTA) yang memiliki efisiensi transfeksi 14,9% (Gambar 4 ). Kami kemudian menyelidiki apakah penurunan lebih lanjut konsentrasi zat besi bebas akan meningkatkan efisiensi transfeksi tanpa efek merugikan pada kesehatan sel dalam penyaringan kedua. Formulasi AMBIC 1.293A yang diuji dalam penyaringan kedua memiliki 30 µM FeEDTA dengan 14–108 µM spike EDTA untuk menyelidiki efek kelasi zat besi lebih lanjut, dan 15 µM FeEDTA dengan 0–14 µM spike EDTA untuk menentukan apakah kesehatan sel dapat dipertahankan dengan konsentrasi zat besi dasar yang lebih rendah. Profil pertumbuhan semua kultur FeEDTA 15 dan 30 µM tampaknya bergantung pada konsentrasi EDTA (Informasi Pendukung S1: Gambar S8 ), karena VCD Passage 3 akhir dan viabilitas keduanya menurun saat konsentrasi EDTA meningkat (Gambar 4 ). Efisiensi transfeksi selama Passage 3 juga meningkat dengan konsentrasi EDTA untuk semua kondisi, dan semua formulasi mendukung efisiensi transfeksi pada atau di atas maksimum 14,9% yang terlihat pada studi pertama (Gambar 4 ). Secara keseluruhan, hasil dari kedua studi menunjukkan bahwa konsentrasi FeEDTA dasar dan jumlah suplementasi EDTA harus seimbang untuk memaksimalkan VCD dan viabilitas sambil mempertahankan efisiensi transfeksi yang dapat diterima. Kultur dengan FeEDTA 15 µM menunjukkan penurunan kesehatan sel dengan kelasi EDTA apa pun, tetapi mempertahankan efisiensi transfeksi yang baik. Pada FeEDTA 30 µM, kelasi dengan EDTA 14–56 µM mempertahankan keseimbangan antara kesehatan sel dan efisiensi transfeksi, dan pada FeEDTA 60 µM, kesehatan sel dapat dipertahankan tetapi efisiensi transfeksi buruk bahkan setelah penambahan EDTA.

Produksi rAAV dicoba dalam formulasi media 15–0, 30–14, dan 30–56 (Fe-FeEDTA) karena kultur penyaringan terkait menunjukkan keseimbangan yang dapat diterima antara VCD terminal, viabilitas terminal, dan efisiensi transfeksi (Gambar 4 ). Kultur dalam FeEDTA/EDTA spiked AMBIC 1.293A menunjukkan profil VCD dan viabilitas yang konsisten relatif terhadap satu sama lain dan kontrol media BalanCD selama produksi rAAV (Informasi Pendukung S1: Gambar S9 ). Selain itu, urutan peringkat untuk titer VG dan efisiensi transfeksi kultur, BalanCD, 30–14, 30–56, kemudian 15–0, adalah sama (Gambar 5 ). Karena media 30–14 mendukung produksi rAAV 1,5 dan 3,6 kali lipat lebih tinggi daripada media 30–56 dan 15–0, 30–14 dianggap sebagai formulasi AMBIC 1.293 akhir. Meskipun titer VG dan efisiensi transfeksi dalam BalanCD masing-masing 2,6 dan 1,2 kali lipat lebih tinggi daripada yang ada di AMBIC 1.293, kami menganggap hasil ini sebagai dasar yang dapat diterima untuk produksi rAAV menggunakan media AMBIC.

3.4 Transfer Sel dan Media AMBIC untuk Pengembangan Proses
Sel yang disimpan dalam AMBIC 1.293 dipindahkan dari Situs A ke Situs B untuk pengembangan proses. Sebelum menjalankan studi DOE untuk mengoptimalkan titer VG, eksperimen pembandingan dilakukan untuk menetapkan kadar dasar produksi rAAV dalam medium BalanCD versus AMBIC 1.293 di Situs B (Informasi Pendukung S1: Tabel S8 ). Titik setel untuk waktu inkubasi, volume kompleksasi, massa DNA/sel, rasio PEI:DNA, dan VCD saat transfeksi ditetapkan berdasarkan hasil studi sebelumnya (Chen et al. 2024 ; Coplan et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ; Grieger et al. 2016 ; Gu et al. 2018 ; Guan et al. 2022 ; Zhao et al. 2020 ). Rasio molar plasmid 1:1:1 digunakan untuk menetapkan titik dasar. Titer VG 4,2 kali lipat lebih tinggi dan VCD terminal 2,2 kali lipat lebih tinggi di BalanCD versus AMBIC 1,293, yang mengungkapkan adanya kesenjangan dalam produktivitas volumetrik dan spesifik antara sistem produksi internal dasar dan sistem produksi komersial.

3.5 Penyaringan DOE
Resolusi IV fraksional faktorial sDOE dilakukan untuk menentukan kondisi transfeksi mana yang perlu dioptimalkan dalam percobaan berikutnya (Informasi Pendukung S1: Tabel S9 ) karena desain seperti itu memungkinkan analisis faktor dampak tinggi (efek utama) tanpa mengacaukannya dengan interaksi dua faktor (Mandenius dan Brundin 2008 ; Vera Candioti et al. 2014 ). Nilai rendah, sedang, dan tinggi untuk tujuh parameter transfeksi ditetapkan berdasarkan literatur (Chen et al. 2024 ; Coplan et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ; Grieger et al. 2016 ; Gu et al. 2018 ; Guan et al. 2022 ; Zhao et al. 2020 ), dan titer VG, efisiensi transfeksi, dan viabilitas sel diukur sebagai respons. Tiga parameter, rasio PEI:DNA, VCD transfeksi, dan pHelper/pGOI, diidentifikasi sebagai faktor signifikan yang memengaruhi titer VG ( p  < 0,05, Informasi Pendukung S1: Tabel S10 ). Rasio PEI:DNA memiliki efek normalisasi terbesar pada titer VG, dan keberadaan efek negatif ini konsisten dengan pengamatan dari penelitian lain (Coplan et al. 2024 ; Fu et al. 2023a ). Respons seluler terhadap toksisitas PEI yang diamati dalam penelitian lain dikaitkan dengan aktivasi protein kinase C (Chung et al. 2023 ), dan protein ini telah terbukti bertahan dalam preparat rAAV yang dimurnikan (Leibiger et al. 2024a ). Kami melihat bahwa titer tertinggi 6/7, efisiensi transfeksi tertinggi 8/10, dan viabilitas rata-rata tertinggi 8/9 kondisi sDOE dijalankan dengan rasio PEI:DNA 1 (Informasi Pendukung S1: Tabel S9 ). Kepadatan sel memiliki efek terbesar berikutnya pada titer VG, dan 6/8 kondisi titer tertinggi memiliki VCD awal 4 × 106 sel /mL (Informasi Pendukung S1: Tabel S9 ). Model PLS dibuat dari data sDOE dan kemampuan prediktif diuji dengan menjalankan kondisi setpoint optimal dalam studi tabung goyang. Titer VG yang diukur adalah 6,14 × 1012 VG /mL, yang 1,4 kali lipat lebih tinggi dari yang diprediksi (Informasi Pendukung S1: Tabel S10 ). Perbedaan ini berada dalam rentang kesalahan pengukuran yang terlihat pada nilai qPCR untuk titer VG (Martinez-Fernandez de la Camara et al. 2021 ; Werling et al. 2015 ), tetapi penggunaan VCD transfeksi optimal yang diperoleh dari model sebesar 5,8 × 106 sel /mL, yang berada di luar ruang desain yang diuji, mungkin juga berkontribusi terhadap perbedaan ini.

3.6 Optimasi DOE Hasil sDOE

dan survei literatur digunakan untuk menginformasikan parameter yang akan ditetapkan versus dieksplorasi lebih lanjut dalam optimasi wajah komposit sentral (CCF) DOE (opDOE). Meskipun memberikan efek utama yang paling signifikan dalam sDOE, kami menetapkan rasio PEI:DNA ke 1 untuk opDOE karena dampak negatifnya pada titer VG, efisiensi transfeksi, dan viabilitas sel dalam sDOE (Informasi Pendukung S1: Tabel S9 ). Total massa DNA per sel, waktu inkubasi, dan volume kompleksasi ditetapkan menjadi 1 pg/sel, 7 menit, dan 3 mL (10%), masing-masing, untuk mencocokkan pengaturan optimal yang diidentifikasi oleh model sDOE (Tabel 1 ). Transfection VCD, yang merupakan variabel signifikan dalam sDOE, dipelajari pada rentang yang lebih tinggi dalam opDOE (2 × 106 –6 × 106 sel /mL) untuk menentukan apakah VCD optimal tinggi yang diperoleh dari model SDOE (5,8 × 106 sel /mL) akan mendukung titer VG yang lebih tinggi dibandingkan VCD yang lebih rendah. Meskipun rasio pHelper:pGOI signifikan ( p  = 0,0299) dalam sDOE sedangkan pHelper:pRepCap tidak signifikan ( p  = 0,176), kami memilih untuk mengeksplorasi kedua parameter dalam opDOE karena hubungannya dengan ekspresi gen. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa secara umum menguntungkan untuk memiliki pGOI sebagai reagen pembatas, tetapi konsensusnya beragam mengenai apakah pRepCap, pHelper, atau kedua plasmid harus dipasok secara berlebihan dibandingkan pGOI (Coplan et al. 2024 ; Gu et al. 2018 ; Liu et al. 2024 ; Park et al. 2024b ; Zhao et al. 2020 ). Model PLS opDOE untuk efisiensi transfeksi (Y 1 ) dan titer VG (Y 2 ) yang dihasilkan dari data yang dikumpulkan (Informasi Pendukung S1: Tabel S11 ) memiliki kecocokan yang sangat baik ( R 2  > 0,95), prediktabilitas yang baik ( Q 2  > 0,75), dan reproduktifitas titik tengah yang sangat baik (Informasi Pendukung S1: Gambar S10 ). Istilah orde pertama untuk transfeksi VCD (X 1 ) dan pHelper/pGOI (X 2 ) signifikan ( p  < 0,05) dalam model opDOE untuk titer VG (Informasi Pendukung S1: Tabel S12 ) seperti yang diamati untuk sDOE (Informasi Pendukung S1: Tabel S10 ) dan studi sebelumnya tentang produksi protein dalam HEK293 (Bollin et al. 2011 ). Selain itu, suku orde kedua untuk VCD transfeksi (X 1 X 1 ) signifikan dalam model opDOE untuk VCD transfeksi dan efisiensi transfeksi (Informasi Pendukung S1: Tabel S12 ). Titik setel optimal model opDOE memiliki VCD 25% lebih rendah sebesar 4,35 × 10 6 sel/mL, pHelper:pRepCap 86% lebih rendah sebesar 0,5, dan pHelper:pGOI 4% lebih tinggi sebesar 0,5 (Tabel 1 ) dibandingkan dengan sDOE. Pengaturan untuk VCD dan pHelper:pRepCap ini serupa dengan yang dilaporkan dari studi DOE lainnya, tetapi titik setel pHelper/pGOI 3,8 hingga 6,5 ​​kali lipat lebih rendah (Coplan et al. 2024 ; Zhao et al. 2020 ). Meskipun terdapat perbedaan dalam pengaturan pHelper/pGOI kami dibandingkan dengan literatur, menjalankan kondisi titik setel optimal dalam labu goyang menghasilkan 1,43 × 10 13 VG/L dengan efisiensi transfeksi 59,0%, yang masing-masing 23% lebih rendah dan 11% lebih tinggi dari nilai prediksi (Tabel 1 ).

Analisis plot kontur untuk efisiensi transfeksi dan titer VG memberikan wawasan lebih jauh tentang bagaimana kedua respons tersebut menunjukkan tren sebagai respons terhadap rasio VCD dan plasmid transfeksi input. Prediksi titer VG dan efisiensi transfeksi maksimum terjadi pada VCD rentang tengah antara 3,5 × 106 –4,5 × 106 sel /mL (Gambar 6 ), dan tren ini juga terlihat ketika hanya memvisualisasikan titik data untuk kondisi opDOE yang diukur (Informasi Pendukung S1: Gambar S11 ). Titer VG yang diukur paling tinggi untuk kondisi dengan VCD transfeksi yang ditetapkan pada 4 × 106 sel /mL, dan kondisi ini memiliki efisiensi transfeksi tertinggi dan viabilitas terminal terendah (Informasi Pendukung S1: Gambar S11 ). VCD transfeksi rentang menengah mungkin optimal karena kebutuhan untuk menyeimbangkan penggunaan sel yang cukup untuk mengakumulasi vektor dalam jumlah yang cukup dan masalah yang diakibatkan oleh “efek kepadatan sel” yang dijelaskan dengan baik yang terjadi pada VCD tinggi karena keterbatasan transfer nutrisi dan plasmid yang diamati dalam kultur batch (Lavado-García et al. 2022 ; Mendes et al. 2022 ; Moço et al. 2023 ). Keterbatasan nutrisi dapat diatasi dengan mengkultur sel dalam perfusi, tetapi penyebab molekuler dari efisiensi transfeksi dan keterbatasan ekspresi gen mungkin perlu dipecahkan menggunakan rekayasa lini sel (Lavado-García et al. 2020 ). Modulasi jalur pensinyalan kalsium dapat membantu meningkatkan produksi rAAV, karena titer VG lebih tinggi dalam kultur dengan ITPRIP (Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Interacting Protein) yang meningkat, protein yang dapat mengendalikan kadar kalsium nuklear (Barnes et al. 2021 ). Penelitian terkini juga menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi gen retikulum endoplasma (Fu et al. 2024 ), melumpuhkan gen pro-apoptosis (Park et al. 2025 ; Strasser et al. 2021 ), dan menghambat jalur interferon dapat meningkatkan hasil rAAV (Wang et al. 2023 ; Wang et al. 2025 ).

Rentang model optimal untuk pHelper/pGOI bergantung pada respons, karena prediksi titer VG mencapai puncaknya saat pHelper/pGOI < 1 sementara prediksi untuk efisiensi transfeksi dimaksimalkan saat pHelper/pGOI adalah 1–3. Model titer VG yang ditetapkan sebelumnya menggunakan metodologi DOE memiliki kondisi optimal dengan pHelper/pGOI > 1 (Coplan et al. 2024 ; Zhao et al. 2020 ), yang cocok dengan hasil kami untuk mengoptimalkan efisiensi transfeksi, tetapi tidak dengan titer VG. Menariknya, analisis VG ddPCR multidimensi dalam opDOE kami yang memantau tiga target genom (promotor, transgen, dan ekor poliA) memberikan wawasan tentang bagaimana kultur dengan rasio pHelper/pGOI yang berbeda dapat memiliki titer VG qPCR target tunggal yang serupa tetapi mungkin mengandung distribusi populasi kapsid penuh dan sebagian penuh yang berbeda (Informasi Pendukung S1: Gambar S12 ). Titik pusat opDOE dan kultur verifikasi menghasilkan rAAV pada titer qPCR target tunggal yang sebanding sebesar 1,19 × 10 13  ± 2,32 × 10 12 VG/mL dan 1,43 × 10 13  ± 3,90 × 10 12 VG/mL, tetapi analisis ddPCR 3D menunjukkan bahwa rasio pHelper:pGOI yang berbeda antara kondisi ini memengaruhi persentase tetesan positif rangkap tiga yang diprediksi mengandung genom berukuran penuh. Kultur titik pusat memiliki pHelper:pGOI yang ditransfeksi > 1 dan diperkirakan 28% genom yang dikemas berukuran penuh, sedangkan kultur verifikasi memiliki pHelper:pGOI yang ditransfeksi < 1 dan diperkirakan 7% genom berukuran penuh. Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa pHelper:pGOI dapat memengaruhi efisiensi pengemasan genom penuh antara kondisi-kondisi yang memiliki titer VG yang serupa, yang dapat mengacaukan upaya-upaya untuk mengoptimalkan model-model untuk titer VG target tunggal. DOE-DOE berikutnya yang hanya berfokus pada memvariasikan rasio-rasio plasmid sebagai masukan dan mempelajari konten kapsid penuh dan parsial sebagai respons-respons dapat menyelesaikan tren-tren dengan lebih baik, khususnya karena efek-efek rasio-rasio plasmid yang dinormalisasi pada titer VG dalam penelitian kami dan penelitian-penelitian lainnya kecil dibandingkan dengan variabel-variabel lain yang diuji (Coplan et al. 2024 ; Wang et al. 2024 ). Strategi-strategi rekayasa garis sel untuk memodulasi siklus sel dan jalur-jalur transkripsi DNA juga dapat membantu meningkatkan populasi-populasi kapsid penuh. Penelitian-penelitian omik terkini telah menunjukkan bahwa komponen-komponen kompleks pori nukleus dan faktor-faktor transkripsi diatur naik untuk memungkinkan ekspresi gen virus selama produksi rAAV, tetapi jalur-jalur transkripsi templat DNA diatur turun. (Gurazada et al. 2025 ; Patra et al. 2024 ; Tworig et al. 2024 ). Peningkatan gen yang secara langsung atau tidak langsung memodulasi replikasi genom virus DNA untai tunggal dapat meningkatkan populasi kapsid penuh, seperti yang ditunjukkan dalam sebuah penelitian yang melihat persentase kapsid penuh yang lebih tinggi setelah peningkatan SKA2 (Barnes et al. 2021).). Meskipun ada potensi untuk optimasi di masa mendatang, kondisi DOE dengan titer VG tinggi yang diproduksi menggunakan platform AMBIC memiliki titer VG yang secara statistik serupa dengan titer VG yang diukur dari kondisi DOE titer tinggi yang telah diuji oleh tim kami menggunakan media komersial di Situs B ( p  = 0,25, uji- t , Informasi Pendukung S1: Gambar S13 ) (Fu et al. 2023a ).

3.7 Produksi rAAV2-eGFP untuk Karakterisasi Analitik
Proses internal dipindahkan ke Situs C untuk produksi vektor pada skala labu 1 L dan untuk karakterisasi analitis guna mengevaluasi perbandingan vektor yang diperoleh dari sistem internal versus komersial (Expi293). Ketika proses AMBIC dijalankan di Situs C, titer VG pra-pemurnian kira-kira dua kali lipat lebih tinggi (2,46 × 10 13 VG/L) daripada di Situs B (1,22 × 10 13 VG/L). Hasil ini menunjukkan keselarasan yang baik antara kinerja proses di seluruh situs, tetapi perbedaan antara situs mungkin muncul karena penggunaan peralatan yang berbeda untuk kultur sel atau titer VG.

3.8 Identitas Kapsid oleh Protein Utuh LC-MS
Analisis protein kapsid virus (VP) utuh dari vektor murni yang dilakukan oleh LC-MS menghasilkan pemisahan yang baik dari tiga protein kapsid virus sebagaimana dibuktikan oleh resolusi puncak dalam kromatogram fluoresensi dan arus ion total (Informasi Pendukung S1: Gambar S14 ). Puncak kemudian ditetapkan ke protein AAV2 VP1, VP2, dan VP3 berdasarkan spektrum massa yang didekonvolusi. Kami mengamati bahwa berat molekul protein VP yang terdeteksi sangat cocok dengan nilai teoritisnya untuk sampel internal dan komersial (Tabel 2 ). Penghapusan metionina N-terminal dan asetilasi alanina dalam VP1 dan VP3 terdeteksi pada kedua sampel, yang merupakan modifikasi yang telah diamati sebelumnya (Tabel 2 ) (Jin et al. 2017 ; Smith et al. 2024 ). Data yang terkumpul menunjukkan bahwa bahan internal sebanding dengan bahan komersial dalam hal massa molekul protein virus dan menunjukkan viabilitas LC-MS untuk verifikasi serotipe yang cepat dan berulang, terlepas dari proses produksi hulu.

Titer 3,9 TU dengan Transduksi In Vitro dan Flow Cytometry
Analisis regresi mengungkapkan bahwa hubungan antara fraksi sel eGFP+ (dari 1) dan MOI bersifat linear ketika MOI < 700 VG/sel dengan R 2  > 0,97 untuk ketiga sampel vektor yang diuji (Informasi Pendukung S1: Gambar S2C ). Fluoresensi median sel eGFP+ bervariasi hingga < 60% (Informasi Pendukung S1: Gambar S2A ). dan persentase sel eGFP+ berkisar antara 2% hingga 45% di wilayah linear, tergantung pada persiapan vektor (Informasi Pendukung S1: Gambar S2C ). Rasio VG/TU yang dihitung dari kemiringan fraksi sel eGFP+ versus garis regresi MOI adalah 1194 VG/TU untuk in-house, 2404 VG/TU untuk komersial, dan 1670 VG/TU untuk preparat vektor Addgene, yang menunjukkan bahwa titer TU ~3-log lebih rendah daripada titer VG (Tabel 3 ). Perbedaan multi-log dalam titer VG dan TU juga telah diamati dalam penelitian lain yang lebih dari 4-log untuk rAAV2-GFP (Zeltner et al. 2010 ) dan lebih dari 5-log untuk rAAV8-eGFP (François et al. 2018 ) ketika uji transduksi bebas pembantu digunakan. Rasio VG/TU bebas pembantu kami bisa lebih rendah (artinya partikel dianggap lebih menular) daripada studi rAAV2 sebelumnya (Zeltner et al. 2010 ) karena perbedaan dalam sistem produksi vektor, sistem transduksi in vitro, dan metode flow cytometry. Perlu dicatat, alur kerja transduksi in vitro kami dalam format suspensi, yang mungkin telah memfasilitasi pengangkutan virus yang lebih efisien ke reseptor permukaan sel. Meskipun tidak digunakan di sini, penambahan virus pembantu selama transduksi juga dapat menurunkan rasio VG/TU yang diukur, karena rasio VG/TU pada orde 1–2 log telah dicatat untuk vektor rAAV2 di sebagian besar (Chahal et al. 2014 ; François et al. 2018 ; Mayginnes et al. 2006 ; Zeltner et al. 2010 ), tetapi tidak semua (Grimm et al. 1999 ), studi yang menggunakan adenovirus pembantu untuk meningkatkan sinyal pengujian.

Meskipun kami tidak menginduksi replikasi genom AAV dalam pengujian kami, sinyal eGFP jelas berada di atas latar belakang, dan kami melihat perbedaan yang terukur dalam titer fungsional antara preparat vektor. Karena nilai VG/TU yang lebih rendah menunjukkan bahwa preparat rAAV lebih menular, analisis kami menunjukkan bahwa preparat vektor internal lebih menular daripada vektor komersial dan bahan referensi Addgene eksternal. Perbedaan rasio VG/TU antara vektor yang diuji di sini mungkin muncul karena perbedaan dalam sel dan media inang hulu, reagen transfeksi, atau proses pemurnian hilir (Eisenhut et al. 2024 ). Menariknya, perbandingan vektor kami (internal dan komersial) yang diproduksi secara internal dan dimurnikan dengan kromatografi afinitas versus vektor yang diproduksi secara eksternal (Addgene) yang dimurnikan dengan ultracentrifugasi gradien iodixanol (IGUC) menunjukkan bahwa metode pemurnian dapat memengaruhi kinerja pengujian. Puncak rentang linier untuk vektor Addgene adalah 1,7 dan 2,8 kali lipat lebih tinggi daripada vektor internal dan komersial (Informasi Pendukung S1: Gambar S2C ), tetapi fluoresensi untuk vektor Addgene jenuh pada MOI yang lebih rendah daripada vektor lain yang diuji (Informasi Pendukung S1: Gambar S2B ). Meskipun tidak ada konsensus pasti mengenai apakah kapsid parsial dan kosong (Gao et al. 2014 ; Lee et al. 2023 ; Troxell et al. 2023 ) atau tidak (Pan et al. 2023 ) memengaruhi efisiensi transduksi, dan oleh karena itu titik di mana respons uji dapat jenuh, ada kemungkinan bahwa sifat yang lebih homogen dari prep vektor Addgene karena pengayaan kapsid penuh melalui IGUC memungkinkan respons yang lebih linier pada rentang MOI yang lebih besar tetapi menyebabkan saturasi sinyal eGFP yang lebih cepat. Secara keseluruhan, pengamatan ini menunjukkan bahwa kehati-hatian harus dilakukan saat menyiapkan vektor untuk pengujian transduksi sehingga perbedaan dalam pemrosesan hilir tidak menyebabkan variabilitas yang tidak diinginkan dalam pengukuran rasio VG/TU.

4 Kesimpulan
Studi ini menunjukkan nilai pengembangan alur kerja manufaktur rAAV yang mencakup pengembangan media, pengoptimalan proses, dan pengujian analitis. Kami menunjukkan bahwa mengurangi kalsium dan menyeimbangkan kadar zat besi relatif terhadap kadar dalam media kultur asli kami untuk produksi antibodi memungkinkan pengembangan AMBIC 1.293, suatu formulasi yang dapat mendukung produksi rAAV. Pendekatan DOE kemudian digunakan untuk meningkatkan titer VG dari proses hulu AMBIC HEK293 agar sesuai dengan titer yang dicapai menggunakan platform komersial di lab kami. Vektor yang dimurnikan yang dihasilkan dari proses internal menggunakan media kultur AMBIC 1.293 memiliki massa molekul protein kapsid virus yang sebanding dengan LC-MS utuh dan rasio VG/TU yang lebih rendah daripada vektor yang diproduksi dari platform komersial. Karena kepadatan sel pada transfeksi diidentifikasi sebagai parameter proses dengan dampak signifikan pada titer VG, alur kerja pengoptimalan dan analisis yang ditetapkan dapat digunakan untuk pengembangan media dan umpan yang mendukung pertumbuhan sel ke kepadatan yang lebih tinggi dan mengatasi masalah dengan efek kepadatan sel selama produksi vektor virus batch. Pekerjaan tambahan untuk lebih mengkarakterisasi hubungan antara pHelper:pGOI dan kapsid yang diprediksi mengandung genom dengan panjang penuh oleh ddPCR juga dapat membantu dalam menetapkan parameter proses yang meningkatkan kualitas produk. Rekayasa host HEK293 baru dengan jalur termodulasi untuk pensinyalan kalsium dan replikasi genom DNA untai tunggal juga dapat membantu meringankan masalah dengan keterbatasan transfeksi pada kepadatan sel tinggi dan pemuatan kapsid dengan genom rAAV parsial. Media dan metode yang dikembangkan di sini juga dapat berfungsi sebagai titik awal untuk menentukan parameter produksi dan kualitas produk tambahan untuk proses dengan muatan rAAV yang dirancang untuk penggunaan terapeutik.