Evolusi Terarah dari Transaminase Selektif ( R ) Menuju Efisiensi Biosintesis Analog Sitagliptin yang Lebih Tinggi

ABSTRAK
Aminasi asimetris yang dikatalisis oleh transaminase (TA) dianggap sebagai pendekatan kimia hijau untuk mensintesis analog farmasi, tetapi kemampuannya untuk menerima substrat untuk mengkatalisis keton yang terhalang secara sterik masih menjadi tantangan. Sitagliptin adalah obat antihiperglikemik untuk mengobati diabetes tipe II. Di sini, kami memanfaatkan TA selektif ( R ) yang efisien untuk melakukan biosintesis analog sitagliptin ( R )-3-amino-1-morfolino-4-(2,4,5-trifluorofenil)butan-1-on. Dimulai dari ( R )-ATA5 yang dibangun sebelumnya, dua putaran evolusi terarah dilakukan melalui penggabungan PCR yang rawan kesalahan, saturasi terarah lokasi, dan mutagenesis kombinatorial. Varian yang dihasilkan ATA5/F189H/S236T/M121H menunjukkan aktivitas 10,2 kali lipat lebih tinggi dan waktu paruh 4 kali lipat lebih baik pada suhu 45°C. Yang terpenting, varian tersebut mampu mengkatalisis aminasi substrat 700 mM dengan konversi hingga 93,1% dan produk ee .> 99% dalam sistem reaksi kosolven, atau melakukan biotransformasi substrat 200 mM dengan konversi 97,6% dan produk ee .> 99% dalam sistem bebas kosolven. Lebih jauh, analisis struktural memberikan wawasan tentang bagaimana mutasi mempengaruhi aktivitas enzimatik dan termostabilitas. Studi ini, yang terdiri dari konstruksi TA selektif ( R ) yang kuat dan rute sintesis baru dengan konversi tertinggi yang pernah dilaporkan, menyediakan referensi untuk pembuatan analog sitagliptin secara industri.