ABSTRAK
Dengan banyaknya fungsi terapeutik, sel punca mesenkimal (MSC) merupakan sumber yang menjanjikan untuk pengobatan regeneratif. Namun, dalam pembuatan MSC, tanpa metode untuk mengeksplorasi efek dari lintasan jangka panjang pada potensi proliferasi sel, desain proses kultur lintasan menjadi menantang. Di sini, untuk desain proses kultur lintasan MSC, kami mengusulkan model untuk memprediksi laju pertumbuhan sebagai fungsi dari tingkat penggandaan populasi kumulatif (cPDL) untuk setiap lintasan. Tiga langkah diterapkan: (1) eksperimen kultur lintasan untuk mengkorelasikan laju pertumbuhan nyata dengan cPDL dilakukan, (2) model untuk memprediksi laju pertumbuhan sebagai fungsi cPDL dikembangkan, dan (3) model untuk merancang kultur lintasan MSC dari sumsum tulang (BM-MSC) dan tali pusat (UC-MSC) dengan simulasi stokastik diterapkan. Dua variabel desain (jumlah lintasan dan waktu pemanenan) diteliti untuk menentukan daerah operasi yang layak sebagai ruang desain probabilistik untuk memenuhi tiga indikator kualitas (tingkat penuaan, tingkat konfluensi, dan jumlah total sel) dengan probabilitas yang diberikan. Akibatnya, 10 dan 62 kondisi dari 165 diidentifikasi sebagai layak untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing, yang akan berkontribusi pada desain proses kultur lintasan MSC industri.
Singkatan
Bahasa Inggris
sumsum tulang
cPDL
tingkat penggandaan populasi kumulatif
Bahasa Inggris
ruang desain
Bahasa Inggris: MSC
sel induk mesenkimal
NRMSE
kesalahan akar kuadrat rata-rata yang dinormalisasi
PDL
tingkat penggandaan populasi
QI
indikator kualitas
RSS
sisa jumlah kuadrat
Universitas California
tali pusar
1 Pendahuluan
Sel punca mesenkimal manusia (MSC) merupakan sumber yang menjanjikan untuk pengobatan regeneratif dengan banyak fungsi terapeutiknya, termasuk potensi multilineage (Pittenger et al. 1999 ). Ada peningkatan permintaan untuk MSC terapeutik dengan berbagai target klinis seperti penyakit kardiovaskular dan gangguan imunologi (Heathman et al. 2015 ). Untuk mengatasi permintaan MSC yang diantisipasi, kultur passage berurutan merupakan langkah awal yang penting untuk penggunaan klinis (Li et al. 2012 ). Dalam proses kultur passage, kultivasi tunggal diulang untuk menghasilkan jumlah sel yang direncanakan di mana kondisi kultivasi dan jumlah passage merupakan parameter utama. Kultur passage rentan terhadap variabilitas sumber sel seperti sumber isolasi (misalnya, sumsum tulang, tali pusat, jaringan adiposa) (Kern et al. 2006 ) dan donor (misalnya, usia (Zaim et al. 2012 ), dan jenis kelamin (Fossett et al. 2012 )).
Ada masalah kualitas karena penuaan replikasi MSC selama proses kultur pasase (Digirolamo et al. 1999 ; Mets dan Verdonk 1981 ). Dalam kasus MSC, sel diploid manusia memiliki batas potensi pertumbuhannya (Hayflick 1965 ); khususnya, laju pertumbuhan menurun seiring peningkatan tingkat penggandaan populasi kumulatif (cPDL) selama kultur pasase (Bruder et al. 1997 ). Misalnya, laju pertumbuhan MSC dari sumsum tulang (BM-MSC) dan tali pusat (UC-MSC) melambat saat cPDL-nya mendekati ~30 (Bonab et al. 2006 ) dan ~50 (Wiese et al. 2019 ), berturut-turut. Lebih jauh lagi, peningkatan cPDL melalui kultur pasase jangka panjang mengganggu efek imunosupresif MSC (Li et al. 2012 ). Penuaan diselidiki secara eksperimental dengan fokus pada cPDL, tetapi efek cPDL pada perjalanan jangka panjang untuk potensi proliferasi sel belum sepenuhnya dipahami, yang membuatnya sulit untuk merancang kultur perjalanan yang mempertimbangkan penuaan.
Model matematika yang meningkatkan pemahaman sistematis dengan menghubungkan atribut kualitas kritis (CQA) dengan parameter proses kritis (CPP) yang mematuhi kerangka kerja Kualitas berdasarkan Desain (ICH 2009 ) dapat menjadi alat yang ampuh untuk mengatasi kesulitan ini. Model memainkan peran penting dalam mendefinisikan ruang desain (DS) dengan jumlah eksperimen yang relatif kecil (Destro dan Barolo 2022 ). Dengan mengeksplorasi setiap kombinasi CPP, wilayah operasi yang layak dapat diidentifikasi sebagai DS sehingga semua CQA dapat memenuhi spesifikasi kualitas. Dalam budidaya MSC, misalnya, DS ditentukan sebagai wilayah operasi yang layak dari kepadatan penyemaian dan rasio perubahan media (yaitu, CPP) sehingga konfluensi dan jumlah total sel (yaitu, CQA) yang diprediksi oleh model kinetik dapat memenuhi spesifikasi kualitas (Hirono et al. 2022 ). Sampai saat ini, beberapa model telah dikembangkan untuk memprediksi laju pertumbuhan untuk kondisi kultur bagian tertentu. Model stokastik diterapkan, di mana dua tingkat kerusakan yang berbeda diterapkan pada sel-sel individual di setiap lintasan dengan mempertimbangkan heterogenitas populasi awal (Jin et al. 2017 ), sedangkan model pembelajaran mesin secara langsung mengorelasikan waktu penggandaan populasi dan karakteristik donor (Mehrian et al. 2020 ). Namun, dari perspektif desain proses, pengembangan model lebih lanjut diperlukan untuk mempertimbangkan efek penuaan untuk berbagai kondisi kultur lintasan.
Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengembangkan model untuk memprediksi laju pertumbuhan sebagai fungsi cPDL untuk setiap pasase untuk desain proses kultur pasase MSC. Tiga langkah diimplementasikan: (1) eksperimen kultur pasase untuk mengkorelasikan laju pertumbuhan dengan cPDL dilakukan, (2) model dikembangkan untuk memprediksi laju pertumbuhan sebagai fungsi cPDL, dan (3) model dengan simulasi stokastik untuk desain kultur pasase BM-MSC dan UC-MSC diterapkan. Akibatnya, wilayah operasi yang layak dari jumlah pasase dan waktu pemanenan didefinisikan sebagai DS probabilistik sehingga tingkat penuaan dan konfluensi dan jumlah total sel dapat memenuhi spesifikasi kualitas dengan probabilitas yang diberikan. Model yang dikembangkan dapat diperluas ke variabel desain lainnya (misalnya, kepadatan penyemaian) dan diintegrasikan dengan model operasi unit (misalnya, penyemaian, kriopreservasi) menuju desain proses kultur pasase MSC industri.
2 Bahan dan Metode
2.1 Percobaan Kultur Passage
Dalam percobaan berikut, MSC yang berasal dari BM (Lot no. 19TL337479; Lonza, Walkersville, MD, AS) dan MSC yang berasal dari UC (disediakan oleh Hyogo College of Medicine, Hyogo, Jepang) digunakan. Untuk semua percobaan, MSC dipanen dalam MSCGM (Lonza) pada suhu 37°C dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% CO 2 . Kepadatan penyemaian adalah 5,0 × 10 3 sel cm –2 , dan penggantian medium dilakukan setiap 3 hari. Pada kultivasi 1 hari, gambar kontras fase diambil menggunakan sistem pencitraan (EVOS XL Core; Thermofisher Scientific, Waltham, MA, AS) pada empat titik, secara acak. Setelah 4 hari pembudidayaan, sel-sel tersebut ditransportasikan melalui perlakuan enzimatik dengan larutan asam tripsin/etilendiamintetraasetat (Thermofisher Scientific) dengan penghitungan sel menggunakan penghitung sel otomatis (TC-20; Bio-rad, Hercules, CA, AS). Sel-sel yang dipanen kemudian disemai untuk pembudidayaan tunggal berikutnya dengan kepadatan penyemaian yang sama (yaitu, 5,0 × 103 sel cm –2 ) dalam kondisi media kultur segar (Gambar 1 ).
Laju pertumbuhan spesifik pada fase pertumbuhan eksponensial, yang terdiri dari nilai kepadatan sel yang terkumpul dan nilai total kepadatan sel yang menempel yang dihitung dari gambar yang ditangkap, diberikan sebagai berikut:
Di mana
adalah laju pertumbuhan spesifik yang diperoleh dari data eksperimen,
adalah kepadatan sel yang dihitung dari gambar yang diambil 24 jam setelah penyemaian, dan
adalah kepadatan sel yang dikumpulkan 96 jam setelah penyemaian.
2.2 Pengembangan Model untuk Proses Budaya Lintasan
Untuk menggambarkan proses kultur pasase, model pasase dikembangkan dan diintegrasikan dengan model kultivasi tipikal, yang menghubungkan tiga set parameter, variabel desain, parameter sumber sel, dan indikator kualitas (QIs) (Gambar 2 ). Secara khusus, variabel desain dan parameter sumber sel digunakan sebagai masukan untuk model kultivasi dan pasase, masing-masing, untuk memprediksi QIs; model pasase dijalankan untuk memprediksi laju pertumbuhan spesifik,
, yang dapat digunakan sebagai masukan untuk budidaya selanjutnya. Di sini, dua variabel desain kultur pasase didefinisikan, yaitu, jumlah pasase,
, yang menentukan jumlah iterasi budidaya tunggal, dan waktu panen,
, yang menentukan waktu kultivasi untuk satu kultivasi. Bersama-sama, tiga QI didefinisikan setelah setiap bagian, sebagai berikut: tingkat penuaan,
, tingkat konfluensi,
, dan jumlah total sel,
Terakhir, model kultivasi dan model passage digunakan untuk mengidentifikasi wilayah operasi yang layak.
Dan
, sehingga semua nilai yang diprediksi,
Bahasa Indonesia:
, Dan
memenuhi spesifikasi kualitas.
Dalam model budidaya, digunakan pertumbuhan eksponensial dan fase stasioner yang khas. Secara khusus, selama fase pertumbuhan,
diasumsikan konstan, sedangkan penghambatan kontak akibat konfluensi diterapkan untuk mewakili fase stasioner. Kepadatan pemanenan,
, setelah
Budidaya tunggal ke-1 diprediksi sebagai berikut:
Di mana
adalah tingkat pertumbuhan spesifik selama
-th budidaya tunggal (konstan selama budidaya tunggal),
adalah kepadatan sel maksimum,
adalah kepadatan penyemaian, dan
adalah fungsi yang mengambil nilai minimum dari input. Di sini,
adalah nilai terbesar dari hasil pengukuran eksperimen (termasuk nilai yang telah dilaporkan sebelumnya) (Hirono et al. 2024 ) dan tetap konstan selama kultur passage. Setelah akhir
– budidaya tunggal, yang dihasilkan
digunakan untuk menghitung cPDL sebagai berikut:
Di mana
adalah hasil perhitungan cPDL yang dihasilkan dari
-langkah-langkah budidaya tunggal (untuk diwariskan kepada generasi berikutnya)
budidaya -th) dan
adalah tingkat penggandaan populasi (PDL) yang dihitung sebagai hasil dari
– budidaya tunggal (akan dihitung ulang untuk
-th budidaya). Diasumsikan bahwa cPDL tetap konstan
selama
-th budidaya tunggal dan kemudian diperbarui menjadi
dengan Persamaan ( 3 ) sebelumnya
-th budidaya. Akhirnya, hasil yang diperoleh
digunakan sebagai masukan untuk model bagian berikut, yang memungkinkan
prediksi dengan memperhitungkan efek penuaan.
Di mana
adalah tingkat pertumbuhan spesifik maksimum,
adalah tingkat penuaan, dan
adalah konstanta model passage yang mewakili cPDL ketika
berkurang 50% dari
Tiga parameter (yaitu,
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
) diperkirakan menggunakan data eksperimen untuk memasukkan variabilitas sumber sel dan tetap konstan selama kultur bagian. Akhirnya, hasil
digunakan untuk budidaya selanjutnya, yaitu perhitungan dilanjutkan dan kembali ke Persamaan ( 2 ).
Bersamaan dengan proses iteratif yang terdiri dari Persamaan ( 2 )–( 4 ), jumlah labu yang akan digunakan untuk budidaya berikutnya juga dihitung pada akhir
– budidaya sebagai berikut:
Di mana
adalah jumlah labu kerja untuk
budidaya -th,
adalah jumlah maksimum labu yang tersedia (konstan selama kultur lintas), dan
adalah fungsi lantai yang mengambil bilangan bulat terbesar yang kurang dari atau sama dengan input.
Setelah berakhirnya kultur passage, keluaran model digunakan untuk memprediksi QIs. Secara khusus, hasil perhitungan
Bahasa Indonesia:
, Dan
digunakan untuk prediksi
Bahasa Indonesia:
, Dan
sebagai berikut:
Di mana
adalah nilai awal dari
Kapan
secara numerik adalah 0 (lihat juga Persamaan ( 4 )), dan
adalah luas permukaan labu. Di sini, kami mendefinisikan
untuk mewakili secara kuantitatif seberapa jauh hasil
menurun dari nilai sebelum memulai kultur passage. Dari definisi tersebut, semakin besar
kurang terpengaruh oleh penuaan, dan
menurun seiring dengan perkembangan budaya passage. Mengenai konfluensi, kami menerapkan indikator sebelumnya untuk memperkirakan konfluensi (Hirono et al. 2024 ); khususnya,
lebih baik, dan parameter ini meningkat seiring dengan kemajuan pertumbuhan selama satu kali kultivasi. Akhirnya, jumlah total sel yang akan dipanen ditentukan dengan jumlah botol kerja yang mempertimbangkan jumlah maksimum botol.
2.3 Estimasi Parameter dan Validasi Model
Estimasi parameter dan validasi model dilakukan untuk menerapkan model yang dikembangkan pada desain proses kultur passage. Untuk setiap sumber sel, data eksperimen dari tiga sampel independen digunakan; dua sampel (misalnya, sampel 1 dan 2) digunakan untuk memperkirakan tiga parameter dalam Persamaan ( 4 ) (yaitu,
Bahasa Indonesia:
, Dan
), dan satu sampel yang tersisa (misalnya, sampel 3) digunakan untuk memvalidasi model. Hanya Persamaan ( 4 ) yang dipasang pada dua sampel menggunakan cPDL sebagaimana diperoleh dari percobaan, sedangkan keseluruhan model (yaitu, Persamaan ( 2 )–( 4 )) divalidasi terhadap sampel yang tersisa. Prosedur ini dilakukan tiga kali dengan kombinasi sampel yang berbeda untuk menghitung rata-rata dari tiga estimasi untuk setiap parameter. Secara khusus, parameter ini diestimasi dengan meminimalkan jumlah kuadrat residual (RSS) dan dievaluasi dengan kesalahan kuadrat rata-rata yang dinormalisasi (NRMSE) antara data eksperimen dan prediksi
untuk cPDL yang sama seperti berikut:
Di mana
adalah jumlah pengukuran,
adalah jumlah sampel, dan
Dan
adalah nilai maksimum dan minimum dari
, masing-masing. Selanjutnya, NRMSE antara prediksi dan sisanya
data untuk nomor bagian yang sama dihitung untuk validasi model.
2.4 Simulasi Stokastik Laju Pertumbuhan Spesifik dan QI
Simulasi stokastik dilakukan berdasarkan data eksperimen, dengan mempertimbangkan variasi yang melekat pada proses kultur lintas. Pertama, untuk mengukur variasi yang dihasilkan dalam
, variabel acak,
, didefinisikan dengan data eksperimen dari tiga sampel independen. Di sini, simpangan baku sampel dihitung antara tiga pengukuran
pada setiap nomor bagian untuk mengasumsikan distribusi normal untuk mewakili kemungkinan variasi dalam
; definisi diberikan sebagai berikut:
Di mana
adalah rata-rata dari
Bahasa Indonesia:
adalah variabel acak untuk mewakili variabilitas,
adalah jumlah sampel,
adalah distribusi normal dengan mean
dan deviasi standar,
Bahasa Indonesia:
adalah nomor bagian dalam percobaan, dan
adalah rata-rata deviasi standar.
Kedua, variabel acak,
, dimasukkan ke dalam model lintasan untuk mensimulasikan kemungkinan variasi dalam
sebagai berikut:
Untuk simulasi stokastik,
diambil secara acak dari distribusi, yang menghasilkan variasi dalam
untuk prediksi selanjutnya.
kemudian digunakan sebagai masukan model budidaya selanjutnya (Persamaan ( 2 )) dan dilanjutkan dengan model pasase yang diulang-ulang sampai akhir kultur pasase.
Ketiga, model kultivasi dan model peralihan diterapkan untuk mensimulasikan kemungkinan variasi dalam
Bahasa Indonesia:
, Dan
di akhir budaya bagian. Simulasi
digunakan untuk memprediksi
(Persamaan ( 7 )) dan
(Persamaan ( 8 )), sedangkan
diterapkan untuk memprediksi
dengan model passage (Persamaan ( 13 )). Hasil yang didapat
nilai digunakan untuk prediksi
(Persamaan ( 6 )). Di sini,
bisa melebihi 1 ketika dihitung
lebih besar dari
, yang konstan. Simulasi ini diulang 10000 kali untuk kondisi kultur bagian tertentu (yaitu,
Dan
).
2.5 Penentuan Ruang Desain
Hasil simulasi stokastik diterapkan untuk menggambarkan himpunan variabel desain yang layak sehingga semua QI yang diprediksi memastikan spesifikasi kualitas berikut:
Di mana
adalah kumpulan spesifikasi kualitas tingkat penuaan,
; tingkat konfluensi,
; dan jumlah total sel,
Ambang batas
didefinisikan dalam penelitian ini sebesar 80% sehingga penuaan tidak dapat terjadi. Ambang batas
ditentukan berdasarkan penelitian sebelumnya dimana MSC lolos sebelum konfluensi mencapai 90% (Bruder et al. 1997 ; Zaim et al. 2012 ), dan
ditentukan berdasarkan dosis yang dijelaskan sebelumnya untuk infark miokard (Lipsitz et al. 2016 ).
Untuk setiap kombinasi variabel desain (yaitu,
Dan
), probabilitas untuk memastikan spesifikasi dihitung dengan algoritma sebelumnya (Hirono et al. 2024 ) untuk mendefinisikan DS probabilistik. Dengan membandingkan probabilitas dan risiko minimum yang dapat diterima yang ditentukan pengguna,
(García-Muñoz et al. 2015 ), wilayah operasi yang layak
Dan
ditentukan sedemikian rupa sehingga probabilitasnya sama dengan atau lebih besar dari
Di sini, 165 kombinasi variabel desain dieksplorasi secara numerik berdasarkan kondisi eksperimen; khususnya,
ditetapkan dari 1 sampai 15 (total 15 kondisi), sedangkan
diselidiki dari Hari ke-2,5 hingga ke-5,0 setiap 0,25 hari (total 11 kondisi).
Di mana
adalah model yang dikembangkan,
adalah probabilitas yang dihitung,
adalah fungsi indikator, yang mengambil nilai 1 jika semua kondisi terpenuhi dan 0 jika setidaknya satu kondisi tidak terpenuhi,
adalah setiap kombinasi dari
Dan
(total 165 kondisi),
adalah jumlah iterasi model untuk suatu kondisi tertentu
Dan
(yaitu, 10000 kali), dan
adalah prediksi model QIs (yaitu,
Bahasa Indonesia:
, Dan
).
Persamaan model dan algoritma untuk simulasi stokastik dan penentuan DS diimplementasikan dengan Python 3.9.13. Total waktu CPU untuk hasil pada Gambar 5 – 8 adalah sekitar 30 menit menggunakan CPU Intel Xeon Gold 6142 @ 2,60 GHz dengan RAM 128 GB.
3 Hasil
3.1 Pertumbuhan Sel Melalui Kultur Passage
Percobaan kultur passage menghasilkan perubahan dalam
sehubungan dengan cPDL (Gambar 3a ) dan
(Gambar 3b ) untuk MSC BM dan UC. Penuaan diamati di kedua MSC; khususnya,
Jumlah BM-MSC dan UC-MSC mulai menurun sekitar nilai cPDL 10 dan 40, masing-masing. BM-MSC mengalami penuaan pada awal masa transisi (
5) namun tingkat penurunannya
lambat (Gambar 3b ). Sebaliknya,
UC-MSC menurun dengan cepat meskipun penuaan dimulai pada akhir masa transisi (
13) (Gambar 3b ). Hasil ini menunjukkan bahwa tren penuaan dapat diinterpretasikan dengan fokus pada kapan penuaan dimulai dan seberapa cepat penuaan tersebut berlangsung.
3.2 Estimasi Parameter dan Validasi Model
Estimasi parameter model passage (yaitu, Persamaan ( 4 )) dilakukan secara individual untuk BM- dan UC-MSC. Metode least squares diterapkan untuk setiap set sampel (Informasi Pendukung S1: Tabel S1 ), yang memperoleh nilai rata-rata parameter (Tabel 1 ) dengan nilai NRMSE yang dihasilkan lebih kecil dari 15% (Gambar 4a , dan Informasi Pendukung S1: Gambar S1 ). Untuk validasi model,
diprediksi untuk setiap bagian dengan nilai yang ditentukan
(Informasi Pendukung S1: Tabel S2 ), menghasilkan nilai NRMSE lebih kecil dari 20% (Gambar 4b , Informasi Pendukung S1: Gambar S1 ), yang menunjukkan bahwa model tersebut dapat mengikuti dampak penuaan pada laju pertumbuhan.
| Sumber sel | Tingkat pertumbuhan spesifik maksimumμm[10 –2 jam –1 ] | Tingkat PenuaanKsr[–] | Konstanta model lintasanK50[–] |
|---|---|---|---|
| Bahasa Inggris | 2.80 | 0.120 | 29.2 |
| Universitas California | Jam 3.30 | 0.332 | 49.3 |
3.3 Simulasi Stokastik Laju Pertumbuhan Spesifik dan QIs
Dengan nilai parameter BM- dan UC-MSC yang diestimasikan, simulasi stokastik dilakukan hingga
15. Sebagai studi kasus, labu multilapis dengan luas permukaan 1720 cm2 diaplikasikan untuk simulasi kultur lintasan di mana jumlah labu awal dan maksimum ditetapkan masing-masing sebesar 1 dan 10.
Pertama, variabel acak,
, didefinisikan mengikuti distribusi normal dengan
diperoleh sebesar 1,80 × 10 –3 jam –1 dan 1,99 × 10 –3 jam –1 untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing. Kedua, hasil
dimasukkan ke dalam model passage untuk simulasi stokastik, menghasilkan variasi yang terdistribusi normal dalam
untuk berbeda
nilai (Hari 3–5) (Gambar 5 ). Hasil ini menunjukkan bahwa semakin lama
Kondisi tersebut menurunkan tingkat pertumbuhan lebih cepat; khususnya,
Hari ke-3 untuk UC-MSC tidak menunjukkan efek penuaan pada laju pertumbuhan. Simulasi ini menghasilkan tingkat variasi yang sama, terlepas dari
Dan
Ketiga, variasi yang dihasilkan dalam
disebarkan ke QIs
Dan
dengan model kultivasi dan model passage. Sifat distribusi normal
tercermin ke dalam
(Gambar 6a ) tetapi diubah menjadi sifat distribusi lognormal
(Gambar 6b ) karena pertumbuhan eksponensial. Secara khusus,
menghasilkan tingkat variasi yang konstan (Gambar 6a ), sedangkan variasi
memiliki distribusi lognormal yang menjadi lebih sempit saat
menurun (Gambar 6b ). Selain itu,
lebih sering mencapai 1.0 ketika
lebih panjang dengan lebih rendah
(Gambar 6b ). Meskipun tren ini
tercermin ke dalam
, nilai prediksi dari
meningkat dengan cepat pada bagian awal karena peningkatan
(Gambar 6c ).
3.4 Penentuan DS
Dari 165 kondisi potensial, kondisi yang memungkinkan untuk kultur pasase ditetapkan secara individual sebagai DS untuk BM- dan UC-MSC. Untuk mengevaluasi kondisi mengenai masing-masing QI, peta probabilitas untuk
Bahasa Indonesia:
, Dan
diperoleh dengan spesifikasi individual
Bahasa Indonesia:
, Dan
, masing-masing, bukan spesifikasi keseluruhan
(Persamaan ( 14 ) dan ( 15 )). Pada peta untuk
, Misalnya,
Hari ke 4 memastikan spesifikasi
dengan probabilitas 90% atau lebih besar hingga nomor bagian 4 dan 12 untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing. Peta-peta ini mengidentifikasi lebih tinggi
nilai dengan lebih tinggi
tidak layak dalam hal penuaan (Gambar 7a ) dan lebih rendah
dengan lebih tinggi
tidak dapat dilaksanakan karena konfluensi (Gambar 7b ). Kondisi yang menyebabkan konfluensi terlalu rendah
(Gambar 7a ) diidentifikasi sebagai sesuatu yang tidak layak dalam hal
(Gambar 7c ) karena tingkat pertumbuhan yang tidak mencukupi. Selain itu, peta untuk
menunjukkan bahwa minimum
adalah 2 untuk kedua MSC, sedangkan minimum
Nilai-nilai tersebut berada pada Hari ke 3,5 dan 3 untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing (Gambar 7c ).
Selain peta probabilitas individual, DS ditentukan sedemikian rupa sehingga ketiga spesifikasi dipastikan secara bersamaan dengan probabilitas 90% atau lebih besar. Sebanyak 10 dan 62 kondisi (dari 165) diidentifikasi sebagai layak untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing (Gambar 8 ). Berdasarkan DS, rentang variabel desain yang layak diidentifikasi; misalnya, ketika
dipilih sebagai 3,
dengan kisaran Hari 3,5–4,25 dan 3–4 diusulkan untuk BM- dan UC-MSC, masing-masing. Selain itu, kondisi yang layak dapat disarankan menurut perspektif yang ditentukan pengguna seperti total waktu untuk kultur lintas; misalnya, (
Bahasa Indonesia:
) dari (3, 3.5) dan (3, 3) diinginkan untuk BM- dan UC-MSC, dengan total waktu masing-masing 10,5 dan 9 hari. Indikator lain juga dapat diintegrasikan dengan DS untuk menentukan kondisi yang lebih baik. Salah satu risiko potensial yang terkait dengan peningkatan
adalah kontaminasi. Dalam hal ini, frekuensi operasi yang melibatkan manipulasi non-aseptik karena meningkatnya jumlah lintasan dapat diparameterisasi untuk menilai lebih lanjut kondisi yang diusulkan oleh DS.
DS juga dipengaruhi oleh variasi
; khususnya, variasi
diperkenalkan oleh
(Persamaan ( 13 )) hilang untuk sebagian besar
Kapan
mengurangi menjadi
, yang merupakan nilai konstan (lihat juga Persamaan ( 2 )). Untuk mengukur dampak dari kemungkinan variasi
pada DS, perbedaan probabilitas,
, dihitung dengan membandingkan
untuk kemungkinan,
, yang menggabungkan variabilitas eksperimental dan sel (yaitu,
Dan
; Persamaan ( 16 )–( 18 )). Variasi
direpresentasikan dengan distribusi normal dengan menerapkan nilai yang ditentukan (Informasi Pendukung S1: Tabel S2 ) sebagai mean dan mengasumsikan deviasi standar 5% berdasarkan hasil eksperimen sebelumnya (Hirono et al. 2024 ; Jossen et al. 2020 ) (Persamaan ( 19 )).
Di mana
adalah prediksi model QIs (lihat juga Informasi Pendukung S1: Gambar S2 ). Variasi yang dihasilkan dalam
kurang dari 2,5% untuk BM- dan UC-MSC (Informasi Pendukung S1: Tabel S3 ), dan variasi yang ditentukan
tidak mempengaruhi DS pada Gambar 8. Hasil ini menunjukkan bahwa DS dapat berfungsi sebagai dasar untuk desain proses kultur lintas MSC industri.
4 Diskusi
Dalam penelitian ini, kami mengembangkan model untuk memprediksi laju pertumbuhan sebagai fungsi cPDL untuk setiap pasase. Sejauh pengetahuan kami, ini adalah pertama kalinya laju pertumbuhan setiap pasase diprediksi dengan cPDL, yang memungkinkan eksplorasi kondisi kultivasi di setiap pasase serta jumlah pasase. Untuk penyelidikan dan aplikasi model lebih lanjut, analisis struktur dan parameter model ini dengan interpretasi biologis akan menjadi penting. Dengan menguraikan model (Persamaan ( 4 )) menjadi dua suku, laju pertumbuhan spesifik maksimum dan suku sisanya, model ini dapat diinterpretasikan sesuai dengan persamaan Monod (Monod 1949 ). Secara khusus, laju pertumbuhan menjadi setengah dari laju pertumbuhan spesifik maksimum ketika cPDL mencapai
pada istilah sisanya, yang sejalan dengan konsep penghambatan pertumbuhan (Han dan Levenspiel 1988 ). Selain itu, turunan pertama dari istilah yang tersisa sehubungan dengan cPDL dihitung sebagai
, Di mana
, yang menunjukkan bahwa
akan relevan dengan hilangnya kapasitas proliferatif sel karena penuaan. Model ini bertujuan untuk menggambarkan tren penurunan laju pertumbuhan berdasarkan fenomena fundamental penuaan dan memiliki struktur/parameter yang serupa dengan karya-karya sebelumnya (Han dan Levenspiel 1988 ; Monod 1949 ). Di sisi lain, model tersebut gagal memperhitungkan tren peningkatan laju pertumbuhan selama masa peralihan awal, terutama untuk UC-MSC (lihat juga Gambar 4 ). Pengetahuan lebih lanjut tentang penuaan dapat membuat model lebih mekanistik, menangkap tren peningkatan dan penurunan, dan pada akhirnya lebih tangguh untuk proses kultur peralihan.
Sementara yang diselidiki
untuk menentukan DS (yaitu, Hari 2,5–5) berbeda dari eksperimen
(yaitu, Hari ke-4), kami menganggap keluaran model dapat diandalkan. Hal ini karena kondisi budidaya, lebih khusus lagi, efek konsentrasi nutrisi pada laju pertumbuhan, selama Hari ke-2,5–5 akan dianggap sama dengan yang digunakan untuk estimasi parameter. Secara khusus, nutrisi (misalnya, glukosa) dalam media kultur diisi ulang dengan melakukan salah satu bagian (ketika
Hari ke 3) atau perubahan sedang (ketika Hari ke 3
), sesuai dengan protokol pabrikan. Dalam konteks ini, ekstrapolasi tersebut
akan dibenarkan, dan dengan demikian, DS yang dihasilkan dapat berguna untuk desain kultur lintasan MSC industri dengan validasi lebih lanjut terhadap kondisi yang diusulkan.
Dalam pembuatan produk berbasis sel, konsep kemampuan manufaktur sel menonjol (Kino-oka et al. 2019 ). Penting untuk memprediksi kualitas sel melalui model karena keterbatasan kapasitas proliferatif. Dalam konteks ini, keuntungan dari model ini adalah kemampuan untuk memprediksi penuaan (yaitu, parameter biologis) tergantung pada jumlah lintasan dan waktu pemanenan. Simulasi kultur lintasan sebelumnya tidak dapat menentukan rentang variabel desain yang dapat diterima karena kurangnya penghitungan cPDL, serta kondisi kultivasi (Jin et al. 2017 ; Mehrian et al. 2020 ). Model yang dikembangkan dapat menyarankan rentang jumlah lintasan dan waktu pemanenan yang dapat diterima berdasarkan DS, yang akan meningkatkan kemampuan proses pembuatan sel.
Keterbatasan potensial dari penelitian ini adalah peningkatan besar dalam pelaksanaan model passage. Secara khusus, model tersebut dilaksanakan setiap waktu panen, yang menjaga cPDL tetap konstan selama satu kali penanaman dan memperbarui cPDL dan
setiap waktu panen. Kekurangan ini dapat diperbaiki dengan menghitung
menggunakan cPDL yang diperbarui; yaitu, peningkatan yang diabaikan dalam
dapat dimasukkan ke dalam prediksi
dan dengan demikian dalam DS yang dihasilkan. Investigasi numerik yang lebih banyak dan/atau model dengan fidelitas yang lebih tinggi akan mengimbangi keterbatasan ini dengan mengorbankan lebih banyak komputasi.
5 Kesimpulan dan Pandangan
Sebuah model baru untuk desain proses kultur pasase MSC telah dikembangkan. Dengan data eksperimen, model tersebut diterapkan untuk desain proses kultur pasase BM dan UC-MSC. Variasi yang diamati secara eksperimen dalam laju pertumbuhan spesifik dimasukkan ke dalam simulasi stokastik dengan distribusi normal, yang memperkirakan variasi dalam tingkat penuaan dan konfluensi, dan dalam jumlah total sel. Akhirnya, kondisi yang layak untuk jumlah pasase dan waktu panen diidentifikasi, sehingga kondisi tersebut memastikan semua spesifikasi kualitas dengan 90% atau lebih.
Pekerjaan di masa mendatang akan mencakup investigasi operasi unit sebelum/sesudah kultur pasase seperti penyemaian (Scholz et al. 2023 ) dan pemanenan (Mawji et al. 2022 ) terhadap desain proses manufaktur MSC. Investigasi yang lebih eksperimental dan numerik juga dapat mengkorelasikan parameter model pasase dengan informasi sumber sel (Mehrian et al. 2020 ) seperti usia donor (Zaim et al. 2012 ) dan jenis kelamin (Fossett et al. 2012 ), yang akan relevan dengan manufaktur MSC industri.
Tata nama
Simbol
(–) set spesifikasi kualitas
(–) spesifikasi kualitas tingkat penuaan
(–) spesifikasi kualitas tingkat konfluensi
(–) spesifikasi kualitas jumlah total sel
(h –1 ) variabel acak yang mewakili variabilitas
(–) mengembangkan model
(%) probabilitas yang dihitung
fungsi indikator (–)
(–) model lintasan konstan
(–) tingkat penuaan
(–) setiap kombinasi variabel desain
(–) jumlah pengukuran
(–) jumlah iterasi model
(–) jumlah sampel
(–) jumlah labu kerja
(–) jumlah maksimum labu yang tersedia
(–) jumlah labu untuk kultivasi berikutnya
(sel) jumlah total sel
(–) nomor bagian
(–) distribusi normal dengan rata-rata
dan deviasi standar dari
(–) tingkat konfluensi
(–) tingkat penuaan
(cm 2 ) luas permukaan labu
(h –1 ) rata-rata simpangan baku sampel
(h) waktu budidaya
(hari) waktu panen
(sel cm –2 ) kepadatan sel
(sel cm –2 ) kepadatan panen
(sel cm –2 ) kepadatan sel maksimum
(sel cm –2 ) kepadatan penyemaian
(–) hasil simulasi stokastik
1 Huruf Yunani
(h –1 ) laju pertumbuhan spesifik
(h –1 ) laju pertumbuhan spesifik maksimum
(h –1 ) laju pertumbuhan spesifik diperoleh dari data eksperimen
(h –1 ) rata-rata laju pertumbuhan spesifik yang diperoleh dari data eksperimen
(%) risiko minimum yang dapat diterima
Leave a Reply