ABSTRAK
Bawang putih merupakan produk hortikultura yang sangat bernilai karena khasiatnya dalam bidang kuliner dan pengobatan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi komposisi ekstrak bawang putih yang bersifat hidrofilik serta pengaruhnya terhadap biologi redoks, penanda Penyakit Alzheimer (AD) dan penuaan, dengan menggunakan Caenorhabditis elegans sebagai model percobaan. Ekstrak tersebut kaya akan senyawa sulfur, yang menyoroti keberadaan senyawa lain seperti fenolik, dan sifat antioksidannya pun diperkuat. Mengenai penanda AD, kapasitas penghambatan asetilkolinesterase telah dibuktikan secara in vitro. Meskipun ekstrak tersebut tidak mengubah derajat kelumpuhan yang diinduksi amiloid β, ekstrak tersebut mampu meningkatkan, dalam cara yang bergantung pada dosis, beberapa parameter lokomotif yang dipengaruhi oleh protein tau yang mengalami hiperfosforilasi dalam C. elegans . Hal tersebut dapat dikaitkan dengan efek yang ditemukan pada pewarnaan transgenik GFP, terutama terkait dengan peningkatan ekspresi gen HSP-16.2. Selain itu, penyelidikan awal terhadap proses penuaan mengungkapkan bahwa ekstrak tersebut berhasil menghambat akumulasi spesies oksigen reaktif intraseluler dan mitokondria pada cacing yang menua. Hasil ini memberikan wawasan berharga tentang dampak multifaset ekstrak bawang putih, khususnya dalam konteks penuaan dan proses neurodegeneratif. Studi ini meletakkan dasar untuk penelitian lebih lanjut yang mengeksplorasi mekanisme molekuler rumit yang mendasari efek bawang putih dan penerapannya ke dalam intervensi terapeutik potensial untuk kondisi neurodegeneratif terkait usia.
1 Pendahuluan
Diet adalah salah satu faktor kunci yang dapat dimodifikasi untuk menjaga kesehatan dan mencegah penyakit, dengan diet seimbang yang kaya akan buah-buahan dan sayuran secara luas terbukti memiliki efek positif pada kesehatan secara keseluruhan (Liu 2013 ; Rosi et al. 2024 ). Senyawa bioaktif yang berasal dari makanan nabati, seperti senyawa fenolik, terpenoid, tanin, dan senyawa organosulfur, berkontribusi pada pencegahan stres oksidatif, peradangan, gangguan metabolik dan kardiovaskular, atau kanker (Godos et al. 2024 ; Qi et al. 2024 ; Regolo et al. 2024 ; Saz-Lara et al. 2024 ). Dalam konteks ini, bawang putih ( Allium sativum L.) menonjol sebagai sumber senyawa bioaktif yang terkenal. Bawang putih adalah produk hortikultura asli Asia Barat dan pantai Mediterania, sangat dihargai sepanjang sejarah karena atribut kuliner dan obat-obatannya (Ansary et al. 2020 ; Jang et al. 2017 ). Profil nutrisinya mencakup jumlah karbohidrat, serat, asam amino, dan mineral esensial (fosfor, kalium, seng, sulfur, kalsium) yang tinggi beserta vitamin (A dan C) (Ansary et al. 2020 ; Ceccanti et al. 2021 ). Selain itu, bawang putih mengandung senyawa bioaktif seperti fenolik dan senyawa sulfur umum (termasuk alliin, s-allyl cysteine (SAC), atau allylpropyl disulfide), yang memberikan beberapa manfaat kesehatan pada produk pangan ini (Ansary et al. 2020 ; Rauf et al. 2022 ). Banyak literatur yang mendukung manfaat kesehatan bawang putih dan produk sampingannya, yang terkait dengan kesehatan kardiovaskular, sifat antikanker, kondisi antiinflamasi, kapasitas antioksidan, atau efek neuroprotektif (Ansary et al. 2020 ; Ghazimoradi et al. 2023 ; Rauf et al. 2022 ; Tedeschi et al. 2022 ).
Bawang putih sangat menarik karena manfaat neuroprotektifnya yang potensial, karena meningkatnya insiden penyakit neurodegeneratif, terutama penyakit Alzheimer (AD), menimbulkan tantangan signifikan bagi masyarakat kontemporer (Organisasi Kesehatan Dunia 2022 ). Baik dalam AD maupun proses penuaan, modulasi pada biologi redoks dan keberadaan stres oksidatif merupakan faktor penting (Navarro-Hortal et al. 2023 ). Selain itu, AD ditandai dengan gangguan pada sistem kolinergik dan proteostasis. Dalam kasus terakhir ini, hal ini mengarah pada akumulasi amiloid-β (Aβ) agregat dan pembentukan jalinan neurofibrilar dari protein tau yang mengalami hiperfosforilasi (Nasb et al. 2024 ). Mengingat populasi yang menua, meningkatnya insiden AD, dan kurangnya pengobatan yang efektif, pencarian strategi pencegahan dan terapi telah meningkat, dan bawang putih bisa menjadi pendekatan yang sangat baik. Meskipun senyawa tertentu dalam bawang putih, terutama allicin, telah dipelajari secara ekstensif, meneliti efek dari keseluruhan makanan dapat menghasilkan hasil yang menarik karena efek sinergis antara komponen-komponennya. Sejauh pengetahuan kami, belum ada penelitian yang menyelidiki efek ekstrak bawang putih pada model Caenorhabditis elegans .
C. elegans telah menjadi organisme model yang berharga untuk menyelidiki patofisiologi penyakit seperti AD, karena jalur neurologis yang sangat terkonservasi pada mamalia. Beberapa model telah dikembangkan untuk mempelajari toksisitas yang diinduksi Tau dan Aβ, dua komponen utama yang terkait dengan patologi AD, yang memfasilitasi identifikasi berbagai target terapi. Penelitian menggunakan model-model ini telah menunjukkan bahwa banyak produk alami dapat berdampak positif pada ciri-ciri utama AD, yang menunjukkan potensinya untuk meningkatkan kesehatan dan mengurangi dampak penyakit (Navarro-Hortal et al. 2022 ).
Oleh karena itu, tujuan awal dari penelitian ini adalah untuk menganalisis profil kualitatif dan kuantitatif senyawa bioaktif, beserta total kapasitas antioksidan (TAC), dalam ekstrak hidrofilik dari bawang putih. Lebih jauh, penelitian ini menggunakan C. elegans untuk penilaian in vivo guna mengeksplorasi potensi toksisitas ekstrak, dampaknya terhadap ekspresi gen terkait biologi redoks, dan efeknya pada beberapa fitur patologis AD. Selain itu, penelitian pendahuluan tentang penuaan telah dilakukan.
2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan Tanaman dan Prosedur Ekstraksi
Varietas bawang putih putih BARI Roshun-1 diperoleh dari Universitas Pertanian Bangladesh dan proses ekstraksi dimulai dengan bubuk bawang putih kering. Sebanyak 80 g sampel diekstraksi dengan 800 mL larutan ekstraksi yang terdiri dari etanol/air (80:20, v/v). Suspensi diaduk (pengaduk magnetik ARE, VELP Scientifica, Usmate, Italia) selama 1 hari pada suhu kamar. Kemudian, disaring menggunakan kertas saring kualitatif Whatman grade 1. Ekstrak etanol bawang putih (GAR) yang diperoleh dipekatkan dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator, kemudian disimpan dalam bentuk alikuot pada suhu -80°C. Untuk penggunaan, ekstrak kering (DE) diencerkan dengan tepat dalam air Milli-Q.
2.2 Karakterisasi Ekstrak
2.2.1 Evaluasi TAC
TAC dievaluasi menggunakan tiga teknik berbeda: uji radikal 2,2-difenil-1-pikril-hidrazil-hidrat (DPPH) dan 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat (ABTS), bersama dengan daya antioksidan pereduksi besi (FRAP), sesuai dengan protokol yang telah ditetapkan sebelumnya (Navarro-Hortal et al. 2022 ; Rivas-García et al. 2022 ; Romero-Márquez et al. 2022a ). Hasil dilaporkan sebagai μmol ekuivalen trolox (TE)/g DE.
2.2.2 Pengukuran Total Phenolic Content (TPC) dan Total Flavonoid Content (TFC)
Penentuan TPC dilakukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu, mengikuti prosedur yang diuraikan oleh Romero-Márquez et al. (Romero-Márquez et al. 2022b ). Kuantifikasi TFC dilakukan sesuai dengan protokol yang diterbitkan sebelumnya (Romero-Márquez et al. 2023 ). Hasil dinyatakan sebagai mg asam galat atau ekuivalen katekin/g DE.
2.2.3 Kondisi Operasi Kromatografi untuk Identifikasi dan Kuantifikasi Senyawa Individual
2.2.3.1 Analisis HPLC-ESI-QTOF-MS/MS
Sampel dianalisis menggunakan metodologi yang sebelumnya dijelaskan dalam bibliografi (Ceccanti et al. 2021 ; Molina-Calle et al. 2017 ). Semua sampel dianalisis dalam rangkap tiga menggunakan kromatografi cair seri Agilent 1260 yang dilengkapi dengan degasser mikrovakum, pompa biner, autosampler termostatik dan kompartemen kolom, dan detektor susunan dioda (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS). Untuk pemisahan komponen sampel, kolom Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 dengan dimensi 4,6 × 150 mm dan ukuran partikel 1,8 μm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS) digunakan. Fase mobil yang digunakan adalah air dengan asam format 0,1% (A) dan ACN dengan asam format 0,1% (B), dengan gradien berikut: 0 menit, fase B 5%; 5 menit, fase B 10%; 23 menit, 95% fase B; 24 menit, 5% fase B, dan terakhir, siklus pengondisian 8 menit dengan kondisi analisis awal untuk menyeimbangkan sistem. Laju aliran yang digunakan adalah 0,5 mL/menit, suhu kolom dipertahankan pada 25°C, dan 5 μL sampel yang disimpan pada suhu 4°C disuntikkan ke dalam kompartemen sampel yang diatur suhunya.
Deteksi senyawa dilakukan dengan detektor Q-TOF Agilent 6540 Ultra High Definition (UHD) Accurate Mass yang dilengkapi dengan antarmuka Jet Stream antarmuka elektrospray ganda (ESI) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS). Deteksi dengan QTOF dilakukan dalam mode ionisasi positif dan negatif, dalam rentang massa m/z 50-1700. N 2 ultramurni digunakan sebagai gas ionisasi dan pengeringan pada suhu masing-masing 325°C dan 400°C, dan aliran masing-masing 10 dan 12 L/menit. Parameter lain yang digunakan adalah: tegangan kapiler, ±4000 V; tekanan N 2 dalam nebulizer, 20 psig; tegangan Q1, 130 V; tegangan nosel, 500 V; skimmer, 45 V dan octopole 1 RF, 750 V. Untuk memastikan resolusi massa yang diinginkan, kalibrasi internal berkelanjutan dilakukan selama analisis dengan menggunakan sinyal pada m/z 121.0509 (purin terprotonasi) dan m/z 922.0098 [hexakis terprotonasi(1H,1H,3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine] dalam mode ion positif; sedangkan pada mode ion negatif, digunakan m/z 112.985587 (anion trifluoroasetat) dan m/z 1033.988109 (aduk heksakis (1H,1H,3H-tetrafluoropropoksi) fosfazin. Selain itu, analisis MS/MS dilakukan pada mode fragmentasi otomatis, dengan mengisolasi dan memecah dua puncak massa paling intens, dengan nilai energi tumbukan berikut: 10, 20, dan 40 eV. Data MS/MS diperoleh menggunakan mode centroid pada laju 2,5 spektra/detik pada mode rentang dinamis yang diperluas (2 GHz).
2.2.3.2 Pengolahan Data, Identifikasi Tentatif, dan Kuantifikasi Metabolit Senyawa
Perangkat lunak MassHunter Workstation (versi B7.00 Analisis Kualitatif, Agilent Technologies) digunakan untuk memproses semua data yang diperoleh oleh LC–QTOF dalam mode akuisisi MS/MS yang bergantung pada data. Pengolahan berkas data mentah dimulai dengan ekstraksi fitur molekuler potensial (MF) dengan algoritma yang sesuai yang disertakan dalam perangkat lunak. Untuk tujuan ini, algoritma ekstraksi mempertimbangkan semua ion yang melebihi 5000 hitungan untuk kedua polaritas dengan satu status pengisian. Nilai batas ini ditetapkan dengan mempertimbangkan derau latar belakang kromatografi. Selain itu, algoritma mempertimbangkan bahwa MF harus memiliki distribusi isotop yang valid yang ditentukan oleh dua ion atau lebih (dengan toleransi jarak puncak m/z 0,0025, ditambah akurasi massa 7,0 ppm). Pembentukan ion dan aduk dalam mode ionisasi positif ( + H, + Na) dan negatif ( − H, + Cl), serta kehilangan netral karena dehidrasi disertakan untuk mengidentifikasi fitur yang sesuai dengan metabolit potensial yang sama. Identifikasi metabolit didukung pada informasi MS dan MS/MS yang dicari dalam database METLIN ( http://metlin.scripps.edu ), Human Metabolome Database (HMDB, versi 3.6), situs web LIPID MAPS ( http://www.lipidmaps.org ) dan literatur ilmiah terkait bawang putih, menggunakan dalam semua kasus MF yang diperoleh dari langkah sebelumnya.
Basis data dengan semua metabolit yang teridentifikasi digunakan untuk melakukan analisis ekstraksi senyawa yang ditargetkan menggunakan jendela toleransi 0,5 menit dan akurasi massa 6 ppm. Langkah ini dilakukan dengan perangkat lunak MassHunter. Sebuah tabel dengan luas puncak semua senyawa yang teridentifikasi dalam sampel yang berbeda yang disuntikkan diperoleh sebagai hasilnya. Data luas puncak digunakan untuk analisis kuantitatif. Senyawa yang diidentifikasi dikuantifikasi akan dilakukan dengan menggunakan standar analitis yang tersedia secara komersial. Senyawa yang standar komersialnya tidak tersedia dikuantifikasi dengan standar pengganti. Kurva kalibrasi dengan 7 tingkat konsentrasi ( n = 7) disiapkan dalam rangkap tiga dan rentang kalibrasi adalah 0,5–15 µg/mL untuk semua standar.
2.3 Penilaian Kapasitas Penghambatan Asetilkolinesterase (AChE) secara In Vitro
Potensi penghambatan AChE dari GAR ditentukan menggunakan versi modifikasi dari metode kolorimetri Ellman (Ellman et al. 1961 ) yang diadaptasi untuk pembacaan pelat spektrofotometri (Romero-Márquez et al. 2024 ). Prosedur ini melibatkan inkubasi 10 mU/mL AChE dengan 150 μM 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) dan berbagai konsentrasi ekstrak GAR, kontrol penghambatan physostigmine, atau air Milli-Q selama 15 menit pada suhu 30°C. Setelah ini, 150 μM acetylthiocholine iodide (substrat) ditambahkan, dan perubahan absorbansi pada 405 nm direkam selama periode 25 menit pada suhu 30°C untuk menentukan aktivitas AChE. Aktivitas penghambatan AChE dinyatakan sebagai persentase penghambatan relatif terhadap kontrol positif, dan konsentrasi ekstrak yang diperlukan untuk mencapai 50% penghambatan aktivitas AChE (IC 50 ) dihitung menggunakan analisis regresi.
2.4 Percobaan Caenorhabditis Elegans
2.4.1 Strain Caenorhabditis Elegans dan Pemeliharaannya
Galur C. elegans yang digunakan dalam penelitian ini meliputi N2 Bristol, LD1, TJ356, TJ375, OS3062, CF1553, CL2166, CL4176, CL802, dan BR5706. Kecuali CL4176 dan CL802, yang disimpan pada suhu 16°C, semua galur lainnya disimpan dalam inkubator (VELP Scientifica FOC 120 E, Usmate, Italia) pada suhu konstan 20°C. Nematoda dikulturkan pada pelat media pertumbuhan nematoda (NGM) yang diolesi Escherichia coli OP50, yang berfungsi sebagai sumber makanannya. Cacing dan bakteri diperoleh dari Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Minneapolis, MI, AS). Untuk semua percobaan, kecuali dinyatakan lain, nematoda yang disinkronkan dengan usia digunakan. Nematoda ini disiapkan dengan memperlakukan nematoda hermafrodit gravid dengan larutan pemutih.
2.4.2 Uji Letalitas
Tingkat kematian cacing N2 yang terpapar berbagai konsentrasi GAR (0, 100, 500, 1000 μg/mL) digunakan untuk mengevaluasi toksisitas akut. Hewan dalam stadium larva L3 dirawat selama 24 jam pada suhu 20°C tanpa makanan. Kemudian, persentase kelangsungan hidup ditentukan menggunakan mikroskop (Motic Inc., LTD., Hong Kong, Tiongkok). Setiap pengujian independen melibatkan minimal tiga pelat NGM, yang masing-masing berisi sedikitnya sepuluh cacing. Hasil kelangsungan hidup 24 jam dinyatakan sebagai persentase total kelangsungan hidup cacing.
2.4.3 Evaluasi Viabilitas Telur
Indikator efektivitas proses perkembangan dalam penilaian toksikologi adalah evaluasi viabilitas telur. Strain N2 digunakan dan minimal 40 telur per kelompok ditempatkan di piring yang berisi E. coli OP50 ditambah perlakuan (0, 100, 500, 1000 μg/mL). Keesokan harinya, jumlah larva dilakukan menggunakan mikroskop, dan temuan dinyatakan sebagai persentase telur yang menetas per kelompok dibandingkan dengan kelompok kontrol (CTL).
2.4.4 Penilaian Pertumbuhan
Dampak perlakuan terhadap perkembangan cacing dinilai melalui uji pertumbuhan. Cacing N2 yang disinkronkan dengan telur ditempatkan di piring NGM dengan GAR (100, 500, 1000 µg/mL) atau tanpa perlakuan dan bakteri dan diinkubasi pada suhu 20°C. Empat hari setelah sinkronisasi, cacing dewasa dicuci dari piring menggunakan media M9 dan dilewatkan melalui Multi-Range Large Particle Flow Cytometer Biosorter (Union Biometrica, Massachusetts, AS) untuk mengukur waktu terbang (TOF), yang menunjukkan panjangnya. Setidaknya 100 hewan diukur untuk setiap perlakuan. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase panjang dibandingkan dengan kelompok CTL.
2.4.5 Kurva Kelangsungan Hidup
Galur N2 digunakan untuk menilai potensi efek toksik jangka panjang GAR pada cacing dan, dengan demikian, kurva kelangsungan hidup dilakukan (Navarro-Hortal et al. 2023 ). Seratus dua puluh cacing L3 yang disinkronkan dipindahkan ke piring baru yang berisi perlakuan atau CTL bersama dengan E. coli OP50 dan dipertahankan pada suhu 20°C. Konsentrasi GAR yang diuji adalah 100, 500, dan 1000 µg/mL. Untuk mencegah bertelur, digunakan 5-Fluoro-2′deoxyuridine (FUDR) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, AS). Kelangsungan hidup cacing dipantau setiap hari, dan dipindahkan ke piring baru dua kali seminggu. Kematian dicatat ketika tidak ada respons terhadap rangsangan mekanis. Cacing yang dikeluarkan dari cawan atau mati dari keturunan di dalam rahim dikeluarkan dari jumlah kematian (dianggap sebagai data tersensor). Data kelangsungan hidup diplot sebagai kurva Kaplan–Meier untuk setiap dosis.
2.4.6 Kuantifikasi Tingkat Spesies Oksigen Reaktif (ROS) Intraseluler dalam Kondisi Stres Oksidatif
Tingkat ROS intraseluler diukur menggunakan teknik diklorodihidrofluorescein diasetat (DCFDA) pada cacing N2. Telur yang disinkronkan ditempatkan pada pelat dengan atau tanpa perlakuan (GAR pada 0, 100, 500, dan 1000 µg/mL). Setelah 48 jam pada suhu 20°C, cacing dicuci dengan media M9 dan kemudian diekspos ke 2,2′-Azobis-2-amidinopropana dihidroklorida (AAPH) 2,5 mM selama 15 menit (tidak termasuk kelompok basal CTL). Selanjutnya, cacing menjalani pencucian M9 tambahan dan diinkubasi lebih lanjut selama 2 jam pada suhu 20°C dengan 25 μM DCFDA. Intensitas fluoresensi sedikitnya 300 cacing per kelompok diukur menggunakan Multi-Range Large Particle Flow Cytometer Biosorter (Union Biometrica, Massachusetts, AS). Hasilnya dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap kelompok CTL, berdasarkan intensitas fluoresensi kuning rata-rata, yang mencerminkan tingkat ROS yang ada.
2.4.7 Strain Transgenik Reporter Protein Fluoresens Hijau (GFP) untuk Gen Terkait Biologi Redoks
Untuk mengeksplorasi mekanisme molekular yang dipengaruhi oleh GAR dalam konteks biologi redoks, berbagai strain termasuk CF1553, TJ375, OS3062, CL2166, TJ356, dan LD1 digunakan. Fokusnya adalah mempelajari gen-gen spesifik, yaitu superoksida dismutase (sod)-3 , protein syok panas ( hsp)-16.2, hsf-1:hsp-16.2:hsp-16.41 , glutathione-S-transferase (gst)-4 , dan faktor transkripsi pembentukan dauer ( daf)-16 dan skinhead (skn)-1 . Nematoda LD1 dan TJ356 transgenik masing-masing mengekspresikan faktor transkripsi SKN-1 dan DAF-16 yang menyatu dengan GFP. Hal ini memungkinkan untuk mempelajari translokasi gen-gen tersebut ke dalam nukleus melalui mikroskopi fluoresensi. Pada neuron kemosensori ASI, skn-1 hadir secara konstitutif, dan menunjukkan akumulasi dalam nukleus intestinal dalam kondisi stres oksidatif. Galur TJ375 dan OS3062 menunjukkan hsp-16.2 yang menyatu dengan GFP dan kombinasi gen hsf-1:hsp-16.2:hsp-16.41 , masing-masing, terutama di bulbus faring anterior. Gen sod-3 menyatu dengan GFP pada CF1553 transgenik, sementara gst-4 menyatu dengan GFP pada galur CL2166.
Telur yang disinkronkan dari setiap galur dikulturkan pada pelat yang berisi CTL atau GAR pada konsentrasi 100, 500, dan 1000 µg/mL selama 48 jam pada suhu 20°C. Setelah inkubasi, nematoda diimobilisasi menggunakan natrium azida pada slide kaca, dan gambar diambil menggunakan mikroskop epi-fluoresensi Nikon (Eclipse Ni, Nikon, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera Nikon DS-Ri2 (Tokyo, Jepang) dan filter GFP. Cacing diamati pada perbesaran 10X kecuali TJ375 dan OS3062, yang diperiksa pada perbesaran ×40. Analisis gambar dilakukan menggunakan perangkat lunak NIS-Elements BR (Nikon, Tokyo, Jepang). Untuk galur TJ356, sistem penilaian semi-kuantitatif digunakan: cacing yang menunjukkan ekspresi DAF-16::GFP sitosolik diberi skor ‘1’, cacing dengan status intermediet menerima skor ‘2’, dan cacing yang menunjukkan lokalisasi nuklir diberi skor ‘3’. Intensitas fluoresensi di seluruh tubuh cacing diukur untuk galur LD1, CF1553, dan CL2166. Area anterior ke bulbus faring diukur untuk mengukur ekspresi HSP16.2::GFP dan HSF-1:HSP-16.2:HSP-16.41::GFP pada cacing TJ375 dan OS3062.
2.4.8 Evaluasi Toksisitas Aβ Melalui Uji Paralisis
Uji kelumpuhan mengikuti protokol yang ditetapkan (Romero-Márquez et al. 2023 ). Galur CL4176 membawa mutasi sensitif suhu yang menyebabkan ekspresi peptida Aβ 1–42 manusia dalam sel otot, yang mengarah ke fenotipe kelumpuhan. Telur yang disinkronkan dari CL4176 didistribusikan pada pelat yang berisi berbagai konsentrasi GAR (0, 100, 500, dan 1000 µg/mL) dengan E. coli OP50 sebagai sumber makanan. Galur CL802 yang tidak dapat dilumpuhkan berfungsi sebagai CTL negatif dalam percobaan. Pelat pertama-tama diinkubasi pada suhu 16°C selama 48 jam dan kemudian dipindahkan ke suhu 25°C untuk menginduksi ekspresi Aβ. Kelumpuhan dipantau dari 20 hingga 32 jam setelah perubahan suhu. Setiap kelompok dan replikasi mencakup setidaknya 25 cacing, dan hasilnya disajikan secara grafis sebagai persentase (%) cacing yang tidak lumpuh dari waktu ke waktu.
2.4.9 Pewarnaan Plak Aβ
Prosedur pewarnaan tioflavin T digunakan untuk memvisualisasikan agregat Aβ mengikuti protokol yang diterbitkan sebelumnya (Navarro-Hortal et al. 2022 ). Cacing dan pelat CL4176 menjalani perlakuan yang sama seperti pada uji kelumpuhan dan, kira-kira pada waktu yang sesuai dengan 50% kelumpuhan CTL, nematoda dikumpulkan dengan mencuci dengan M9. Hewan difiksasi dengan selama 24 jam pada suhu 4 °C dan dipermeabilisasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Kemudian, penyangga permeabilisasi dihilangkan dengan mencuci dengan M9 dan cacing diwarnai dengan 0,125% tioflavin T selama 30 menit. Selanjutnya, mereka dihilangkan pewarnaannya dengan pencucian etanol berurutan (50%, 75%, 90%, 75%, dan 50% v/v), masing-masing selama 2 menit. Cacing yang diwarnai Thioflavin T divisualisasikan menggunakan mikroskop epi-fluoresensi Nikon (Eclipse Ni, Nikon, Tokyo, Jepang) pada perbesaran ×40. Gambar diambil dengan kamera Nikon DS-Ri2 (Tokyo, Jepang) menggunakan filter GFP. CL802 yang tidak diobati dianggap sebagai CTL negatif dan CL4176 tanpa GAR adalah CTL positif.
2.4.10 Penilaian Proteotoksisitas Tau
Pengaruh GAR pada berbagai konsentrasi (100, 500, dan 1000 µg/mL) pada parameter lokomotif diteliti menggunakan model tauopati C. elegans , yang memberikan wawasan berharga mengenai patofisiologi AD. Galur BR5706, yang dikenal karena ekspresi pan-neuronalnya terhadap agregat protein Tau, menunjukkan gangguan lokomosi pada usia dewasa. Setelah inkubasi selama 72 jam pada suhu 20°C dengan atau tanpa perawatan, pergerakan cacing dinilai menggunakan uji renang. Sistem Pencitraan WormLab (MBF Bioscience, Williston, Vermont, AS) digunakan untuk merekam, melacak, dan menganalisis lokomosi cacing, dengan fokus pada parameter seperti indeks aktivitas, panjang gelombang, dan amplitudo dinamis sebagai indikator perilaku lokomotif.
2.4.11 Pengukuran Kandungan ROS Intraseluler dan Mitokondria pada Penuaan
Untuk cacing muda (berusia 5 hari) dan tua (berusia 12 hari), cacing N2 pada stadium L3 dipaparkan pada 100 µg/mL GAR atau kontrol masing-masing (CTL). Cacing kemudian diinkubasi pada suhu 20°C hingga titik akhir. Setelah masa inkubasi, kadar ROS intraseluler diukur menggunakan DCFDA, seperti yang dijelaskan sebelumnya di bagian 2.4.6. Kadar ROS mitokondria diukur menggunakan pewarna Mitotracker Red CM-H2 XRos 10 µM. Kelompok CTL yang terdiri dari cacing muda (berusia 5 hari) disertakan dalam penelitian. Untuk mencegah bertelur selama fase fertil, 15 µg/mL FUDR (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, AS) diberikan.
Selain itu, kelompok yang menua dipindahkan ke piring baru dengan perlakuan segar dan makanan dua kali seminggu untuk kelompok yang menua, sedangkan kelompok yang muda dipindahkan sekali (Navarro-Hortal et al. 2024 ). Multi-Range Large Particle Flow Cytometer Biosorter (Union Biometrica, Massachusetts, AS) digunakan untuk mengukur intensitas fluoresensi minimal 300 cacing per kelompok. Hasil dinyatakan sebagai persentase CTL, berdasarkan intensitas fluoresensi rata-rata untuk fluoresensi kuning (ROS intraseluler) dan merah (ROS mitokondria).
2.4.12 Pengukuran Kandungan Lipofuscin
Cacing CTL pada cacing dewasa berumur 5 hari dan cacing dewasa berumur 12 hari, yang diobati atau tidak diobati dengan 100 µg/mL GAR, dipasang pada slide kaca menggunakan medium M9 dan natrium azida untuk melumpuhkannya. Gambar fluoresensi diambil dengan mikroskop epi-fluoresensi (Eclipse Ni, Nikon, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera. Gambar diperoleh dengan lensa objektif ×10 dan autofluoresensi cacing dianalisis menggunakan perangkat lunak NIS-Elements BR (Nikon, Tokyo, Jepang) (Navarro-Hortal et al. 2023 ). Minimal 30 cacing per kelompok diukur. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase CTL menggunakan rata-rata intensitas fluoresensi biru total (DAPI) untuk setiap cacing.
2.4.13 Analisis Statistik
Untuk mengevaluasi kenormalan dan homogenitas variabel, uji Kolmogorov–Smirnov dan Levene digunakan, masing-masing. Untuk variabel yang tidak mengikuti distribusi normal, digunakan uji nonparametrik. Variabel dengan distribusi normal dianalisis menggunakan uji t atau ANOVA satu arah, diikuti oleh uji post hoc Bonferroni untuk beberapa perbandingan. Data yang tidak terdistribusi normal dinilai dengan uji Kruskal–Wallis dan Mann–Whitney U. Hasil dinyatakan sebagai mean ± standard error of the mean (SEM) dari sedikitnya tiga eksperimen independen, kecuali dinyatakan lain. Signifikansi statistik ditentukan pada p < 0,05. Kurva rentang hidup dianalisis menggunakan uji Log-rank. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan IBM SPSS versi 24.0 (Armonk, NY, AS).
3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Karakterisasi GAR
Mengonsumsi bawang putih telah dihubungkan dengan berbagai keuntungan kesehatan dan menawarkan perlindungan terhadap berbagai kondisi kronis seperti diabetes, kanker, penyakit metabolik dan kardiovaskular, dan hipertensi (Ansary et al. 2020 ; S. Li et al. 2022 ; Tudu et al. 2022 ). Banyak dari efek yang diamati telah dikaitkan dengan kandungan zat gizi mikro dan fitokimia yang tinggi. Dengan demikian, GAR yang diselidiki dalam penelitian ini dikarakterisasi dari sudut pandang TAC, TPC, dan TFC melalui metode kolorimetri. Selanjutnya, kromatografi cair yang digabungkan dengan spektrometer massa digunakan untuk menentukan profil kualitatif dan kuantifikasi senyawa dalam semua sampel. Informasi Pendukung S1: Tabel S1 memberikan informasi tambahan tentang identifikasi, termasuk fragmen MS/MS dari setiap senyawa.
Data untuk semua teknik kolorimetri dikumpulkan dalam Tabel 1. TAC yang dievaluasi dengan metode FRAP dan DPPH berada dalam rentang yang sama, menemukan nilai masing-masing 54,2 ± 1,31 µM trolox/g DE dan 33,1 ± 3,83 µM trolox/g DE. Namun, GAR mengerahkan kemampuan yang lebih tinggi untuk melawan radikal bebas ABTS, yang dinyatakan sebagai 167 ± 6,69 µM trolox/g DE. Kemampuan itu dapat dikaitkan dengan TPC dan TFC yang ditemukan dalam ekstrak. TPC ditemukan sebesar 10,3 ± 1,31 mg asam galat/g DE dan TFC sebesar 0,71 ± 0,11 mg katekin/g DE. Kandungan itu mirip dengan nilai dari ekstrak larut lemak bawang putih hitam yang dinilai oleh Lu et al. ( 2023 ), tetapi sampel kami memiliki kandungan flavonoid yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang dianalisis oleh Jang et al. ( 2017 ).
Kromatogram positif dan negatif yang diperoleh dengan HPLC-ESI-QTOF-MS/MS ditunjukkan pada Gambar 1. Senyawa yang diidentifikasi secara tentatif dikarakterisasi menggunakan basis data senyawa dan literatur ilmiah khusus untuk bawang putih. Identifikasi ini didasarkan pada rumus molekul yang diperoleh dari data distribusi massa dan isotop yang tepat, bersama dengan waktu retensi dan pola fragmentasi yang terekam. Sebagian besar senyawa sebelumnya telah diidentifikasi dalam ekstrak bawang putih dalam bibliografi (Ceccanti et al. 2021 ; Liu et al. 2020 ; Matsutomo et al. 2018 ; Molina-Calle et al. 2017 ). Senyawa yang diidentifikasi secara tentatif tercantum dalam Tabel 2 yang diklasifikasikan menurut famili/kelas. Sebanyak 53 senyawa telah diidentifikasi secara tentatif, di antaranya asam amino dan senyawa organosulfur menonjol. Pada tingkat yang lebih rendah, senyawa dari keluarga nukleosida, peptida, dan turunan juga diidentifikasi, serta beberapa senyawa fenolik (misalnya, asam kumarat atau propil galat). Di antara asam amino yang ditemukan dalam GAR, beberapa di antaranya dianggap penting bagi manusia seperti isoleusin/leusin, lisin, triptofan, fenilalanin, dan valin, tetapi juga jenis yang tidak penting diidentifikasi seperti asparagin, turunan arginin, prolin, dan tirosin. Senyawa organosulfur adalah turunan l -sistein, yang menonjolkan alil- l -sistein sulfoksida (alliin), ɣ −Glutamyl-S-alil- l- sistein, ɣ −Glutamyl-S-aliltio- l- sistein, atau -Glutamyl-S-metil- l – sistein. Konsentrasi semua senyawa yang diidentifikasi sementara dalam GAR dikumpulkan dalam Tabel 3 , dinyatakan dalam mg senyawa/g DE. Senyawa yang lebih pekat dalam sampel ini adalah dimetilamino-propanol (182 ± 5 mg/g), prolin (132,2 ± 2,9 mg/g), glutamil-S-alil- l -sistein isomer 1 (35,6 ± 0,7 mg/g) dan 2 (22,5 ± 0,2 mg/g), 2-hidroksibenzamida (22,4 ± 0,5), propil galat (15,9 ± 0,6 mg/g), dan asam kumarat (16,3 ± 0,2 mg/g). Senyawa-senyawa tersebut termasuk dalam famili/kelas senyawa paling melimpah yang disebutkan di atas dalam sampel ini, yaitu asam amino dan senyawa sulfur yang berasal dari l -sistein, meskipun konsentrasi yang menonjol ditemukan untuk senyawa fenolik seperti asam kumarat. Meskipun profilnya sesuai dengan literatur (Ceccanti et al. 2021 ; Liu et al. 2020 ; Matsutomo et al. 2018 ; Molina-Calle et al. 2017 ), senyawa yang biasanya ditemukan seperti dialil disulfida atau alil metil sulfida tidak teridentifikasi dalam sampel kami (HK Kim 2016 ; Lu et al. 2023 ; Molina-Calle et al. 2017; Recinella et al. 2022 ). Hal ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa jenis senyawa dan kandungannya berbeda-beda, tergantung pada varietas bawang putih dan tahap pertumbuhannya (Liu et al. 2020 ). Meskipun senyawa utamanya adalah senyawa sulfur, beberapa senyawa fenolik juga hadir. Misalnya, keberadaan asam kumarat dalam ekstrak siung bawang putih juga dijelaskan oleh Recinella et al. (Recinella et al. 2022 ).
3.2 Evaluasi Efek Toksik GAR pada Model C. Elegans
Potensi toksisitas GAR pada model C. elegans dievaluasi melalui beberapa pengujian, termasuk tingkat kematian, pertumbuhan dan viabilitas telur untuk toksisitas akut, dan kurva kelangsungan hidup untuk toksisitas jangka panjang. Galur tipe liar N2 digunakan dalam semua pengujian yang dilakukan dan konsentrasi 100, 500, dan 1000 µg/mL diterapkan. Sejauh pengetahuan kami, belum ada penelitian yang menyelidiki efek ekstrak etanol bawang putih pada C. elegans . Oleh karena itu, pemilihan dosis didasarkan pada penelitian yang diterbitkan sebelumnya menggunakan matriks hortikultura (Navarro-Hortal et al. 2024 ), dengan tujuan untuk memastikan kemanjuran sambil meminimalkan potensi toksisitas. Uji kelangsungan hidup 24 jam dan viabilitas telur tidak menunjukkan efek toksik . Demikian pula, toksisitas bawang putih dievaluasi pada Drosophila melanogaster melalui persentase individu yang lahir sehubungan dengan CTL negatif dan hasilnya menunjukkan tidak adanya toksisitas sama sekali dalam hal itu (Toledano Medina et al. 2019 ). Sebaliknya, pengobatan GAR kami menghasilkan panjang cacing yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok CTL
Mengenai penilaian efek toksik jangka panjang, hasil dari kurva kelangsungan hidup menunjukkan bahwa semua konsentrasi GAR memberikan efek negatif pada umur, menurut uji Long-Rank ( p < 0,05) . Faktanya, 100, 500, dan 1000 µg/mL mengurangi kelangsungan hidup maksimal dalam 3, 6, dan 7 hari, masing-masing, dibandingkan dengan cacing yang tidak diobati. Efeknya dapat ditingkatkan oleh kandungan tinggi dalam senyawa sulfur. Dalam hal itu, telah dijelaskan bahwa tiol makanan (N-asetilsistein dan GSH) memperpendek umur pada C. elegans dengan menghambat ekspresi gen anti-penuaan seperti DAF-16/Forkhead box protein O (FOXO) dan SKN-1/Nuclear factor erythroid 2-related factor (Nrf) 2 (Gusarov et al. 2021 ).
3.3 Evaluasi Pengaruh GAR terhadap Penanda Biologi Redoks
Penuaan dan penyakit terkait usia sangat dipengaruhi oleh status redoks seluler. Dalam kasus AD tertentu, stres oksidatif dianggap sebagai peristiwa kritis dalam patogenesis AD dan terkait dengan agregasi Aβ dan fosforilasi dan polimerisasi tau, dua ciri khas penyakit (H. Li et al. 2021 ). Oleh karena itu, kapasitas ekstrak untuk memodulasi stres oksidatif dan ekspresi gen terkait biologi redoks dievaluasi dalam berbagai galur transgenik C. elegans . Stres oksidatif diinduksi oleh AAPH, dan kandungan ROS diukur melalui probe DCFDA pada galur N2. Seperti yang dipaparkan dalam Gambar 4 , AAPH menyebabkan kandungan ROS yang lebih tinggi, yang dinetralisir oleh tiga dosis GAR. Konsentrasi terendah (100 dan 500 µg/mL) memberikan efek yang sama di antara keduanya sedangkan yang tertinggi lebih kuat, bahkan menyebabkan kandungan yang lebih sedikit daripada kelompok dasar CTL. Senada dengan itu, beberapa percobaan yang dilakukan pada kultur sel menunjukkan potensi efek bawang putih dalam mengurangi kandungan ROS (HK Kim 2016 ; Lv et al. 2017 ; Manral et al. 2016 ; Peng et al. 2002 ), juga mengurangi kerusakan oksidatif pada hewan pengerat (Kaur et al. 2021 ; Manral et al. 2016 ; Zhang et al. 2018 ).
Efek pencegahan ROS yang disebutkan dapat dikaitkan dengan aktivitas pemulung GAR, seperti yang ditunjukkan oleh teknik antioksidan in vitro, dan/atau karena modulasi jalur pensinyalan in vivo. Di antara jalur antioksidan utama dalam C. elegans , yang disorot adalah pensinyalan insulin/faktor pertumbuhan mirip insulin 1 (IGF-1) (IIS) melalui faktor transkripsi DAF-16/FOXO dan SKN-1/Nrf2, yang menginduksi ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam respons antioksidan seperti mitokondria sod-3, gst-4 dan HSP kecil (S.-H. Kim et al. 2019 ; Meng et al. 2017 ; Murphy et al. 2003 ; Zečić and Braeckman 2020 ). Dalam konteks itu, galur reporter berlabel GFP digunakan untuk lebih memahami efek perlakuan GAR pada jalur pensinyalan dan protein yang terkait dengan biologi redoks. Dengan demikian, lokasi DAF-16/FOXO dan ekspresi SKN-1/Nrf2, SOD-3, GST-4, HSP-16, dan HSP dievaluasi.
Efek pencegahan ROS yang disebutkan dapat dikaitkan dengan aktivitas pemulung GAR, seperti yang ditunjukkan oleh teknik antioksidan in vitro, dan/atau karena modulasi jalur pensinyalan in vivo. Di antara jalur antioksidan utama dalam C. elegans , yang disorot adalah pensinyalan insulin/faktor pertumbuhan mirip insulin 1 (IGF-1) (IIS) melalui faktor transkripsi DAF-16/FOXO dan SKN-1/Nrf2, yang menginduksi ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam respons antioksidan seperti mitokondria sod-3, gst-4 dan HSP kecil (S.-H. Kim et al. 2019 ; Meng et al. 2017 ; Murphy et al. 2003 ; Zečić and Braeckman 2020 ). Dalam konteks itu, galur reporter berlabel GFP digunakan untuk lebih memahami efek perlakuan GAR pada jalur pensinyalan dan protein yang terkait dengan biologi redoks. Dengan demikian, lokasi DAF-16/FOXO dan ekspresi SKN-1/Nrf2, SOD-3, GST-4, HSP-16, dan HSP dievaluasi.
Nukleasi DAF-16/FOXO secara signifikan lebih rendah setelah perlakuan GAR, sebagaimana tercermin pada grafi dan gambar representatif cacing . Ekspresi gen SKN-1/Nrf2 tidak dimodulasi oleh 100 dan 500 µg/mL GAR, tetapi konsentrasi tertinggi menghasilkan intensitas fluoresensi yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok CTL (Gambar 5C,D ). Senada dengan itu, penulis menemukan bahwa asam p -coumaric, asam hidroksisinamat yang ditemukan dalam ekstrak kami (Yue et al. 2019 ), serta senyawa tioalil (Ogawa et al. 2016 ), masing-masing meningkatkan nukleasi dan ekspresi SKN-1 dalam C. elegans tanpa memengaruhi jalur DAF-16. Efek yang diamati pada faktor transkripsi terkait dengan modulasi ekspresi gen hilir, seperti enzim SOD-3 dan GST-4. Ekspresi SOD-3, yang utamanya dimodifikasi oleh DAF-16, juga lebih rendah pada kelompok yang diberi perlakuan (Gambar 6A,B ). Secara konsisten, penulis lain telah menemukan penghambatan jalur pensinyalan DAF-16/FOXO oleh tiol makanan (N-asetilsistein) (Gusarov et al. 2021 ). Gangguan pada ekspresi sod-3 dapat dikaitkan dengan efek pemendekan masa hidup GAR yang disebutkan sebelumnya (Harris-Gauthier et al. 2022 ; Van Raamsdonk dan Hekimi 2012 ). Lebih jauh, GST-4, yang merupakan hilir dari SKN-1/Nrf2, sedikit lebih tinggi pada kelompok 1000 µg/mL meskipun secara statistik tidak signifikan (Gambar 6C,D ). Mengenai protein syok panas, ekspresi HSP-16.2 lebih tinggi dalam tiga kelompok yang diobati (Gambar 7A,B ), tetapi tidak mengubah ekspresi HSF-1:HSP16.2:HSP16.41 dalam galur transgenik OS3062 (Gambar 7C,D ). Seperti disebutkan, dosis tertinggi (1000 µg/mL) adalah pengurangan konten ROS yang diinduksi AAPH yang lebih kuat, yang juga merupakan konsentrasi yang mampu memodulasi lebih banyak faktor transkripsi dan protein terkait redoks. Oleh karena itu, hasil tersebut mungkin menunjukkan bahwa konten ROS yang lebih rendah yang diamati dalam stres yang diinduksi AAPH dapat disebabkan oleh aktivitas pemulung dari perlakuan, yang juga ditunjukkan oleh uji kolorimetri, aktivasi SKN-1 dan HSP-16.2, dan/atau aktivasi jalur pensinyalan lainnya.
3.4 Evaluasi Efek GAR pada Penanda Penyakit Alzheimer
Dampak GAR pada AD diselidiki dengan menilai tiga penanda berbeda: kapasitas penghambatan in vitro dari AChE, dan efek in vivo pada proteotoksisitas yang diinduksi Aβ dan tau. Mengenai penghambatan AChE, GAR menunjukkan IC50 sebesar 1145 ppm, ditentukan dari kurva dosis-respons dan dihitung menggunakan persamaan y = −3E-05×2 + 0,086x − 9,1318 ( R2 = 0,9957 ). Bawang putih atau senyawanya seperti SAC atau allicin juga memiliki sifat itu, seperti yang tercermin dalam eksperimen in vitro (Kumar 2015 ; Yoshioka et al. 2021 ) dan in vivo (Baluchnejadmojarad et al. 2017 ; Kaur et al. 2021 ; Zarezadeh et al. 2017 ).
Efek GAR pada toksisitas Aβ, yang dievaluasi dengan uji kelumpuhan, Seperti yang dapat dilihat dalam grafik , pengobatan dengan GAR pada dosis 100, 500, atau 1000 µg/mL tidak mengubah perkembangan fenotipe kelumpuhan: selama keseluruhan percobaan, tidak ada perbedaan antara persentase cacing yang lumpuh pada kelompok CTL positif dan kelompok yang diobati. Pada garis itu, jumlah protein agregat yang sama diamati pada cacing yang diobati dengan CTL dan GAR . Sebaliknya, ekstrak bawang putih menunjukkan potensi anti-agregasi Aβ dalam percobaan in vitro (Gupta et al. 2009 ; Gupta dan Rao 2007 ) dan senyawa seperti allicin memodulasi jalur pemrosesan protein prekursor Aβ (APP) (Zhang et al. 2018 ) dan mengurangi kadar Aβ 1-42 (Kaur et al. 2021 ) dalam model AD murine. Namun, mengenai ekstrak GAR yang diuji dalam penelitian saat ini, ekstrak tersebut tidak memberikan manfaat apa pun terhadap fenotipe kelumpuhan yang diinduksi Aβ. Kurangnya efektivitas GAR ini mungkin disebabkan oleh perbedaan konsentrasi senyawa sulfur yang terdapat dalam ekstrak yang diaplikasikan pada cacing dibandingkan dengan yang diberikan pada hewan pengerat.
Pengaruh GAR pada proteotoksisitas yang diinduksi tau dinilai dengan menggunakan strain C. elegans BR5706. Ia mengekspresikan protein tau manusia pro-agregat secara pan-neuronal dan konstitutif, yang menyebabkan cacat lokomosi. Dalam penelitian ini, hewan diinduksi untuk berenang untuk mendorong gerakan (Navarro-Hortal et al. 2022 ) dan efek GAR pada gangguan lokomosi yang diinduksi tau dievaluasi. Sistem dan perangkat lunak WormLab digunakan untuk menganalisis perilaku lokomotif, dengan fokus pada tiga parameter: indeks aktivitas, panjang gelombang, dan amplitudo dinamis (usaha peregangan). Aktivitas mengukur frekuensi sapuan kuas yang dinormalisasi dari waktu ke waktu; panjang gelombang menilai tingkat kelengkungan tubuh; dan amplitudo dinamis memperkirakan jenis lengkungan tubuh (dalam atau datar) dan intensitas upaya “peregangan” selama gerakan. Indeks aktivitas tidak dimodulasi oleh pengobatan (Gambar 9A ), tetapi dua parameter lainnya ditingkatkan secara bergantung dosis (Gambar 9B,C ). GAR menyebabkan nilai panjang gelombang yang lebih tinggi dan upaya peregangan yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok CTL: 100 µg/mL menurunkan upaya peregangan sekitar 28%; 500 µg/mL memodulasi panjang gelombang sekitar 13% dan upaya peregangan hingga 37%; 1000 µg/mL memodulasi panjang gelombang hingga 18% dan upaya peregangan hingga 40%. Oleh karena itu, meskipun aktivitas terganggu yang disebabkan oleh tau tidak terpengaruh, GAR memperbaiki kelengkungan dan upaya yang diperlukan untuk gerakan tersebut. Literatur tentang bawang putih atau senyawanya dan toksisitas yang diinduksi tau sangat langka, tetapi beberapa penulis menemukan bahwa ekstrak bawang putih tua (AGE) dan SAC menurunkan imunoreaktivitas Tau2 (Chauhan 2006 ) dan allicin mengurangi fosforilasi tau (Y.-F. Zhu et al. 2015 ) pada hewan pengerat. Selain itu, ekstrak alami lainnya seperti ekstrak metanol stroberi (Navarro-Hortal et al. 2023 ), ekstrak daun zaitun yang kaya oleuropein (Romero-Márquez et al. 2022a ), ekstrak buah zaitun yang kaya hidroksitirosol (Romero-Márquez et al. 2022b ), atau ekstrak brokoli (Navarro-Hortal et al. 2024 ) meningkatkan perilaku lokomotif pada galur transgenik yang sama.
3.5 Evaluasi Pengaruh GAR pada Penanda Stres Oksidatif pada Penuaan
Mengingat implikasi signifikan bagi kesejahteraan sosial dan kesehatan dalam konteks penuaan dan mengakui bahwa AD adalah kondisi yang secara inheren terkait dengan penuaan, telah dilakukan penilaian awal GAR dalam skenario fisiologis ini, dengan fokus khusus pada status oksidatif. Oleh karena itu, kami menilai pengaruh GAR pada kandungan ROS intraseluler dan mitokondria, serta lipofuscin, pada nematoda tipe liar N2 yang menua. Berdasarkan percobaan sebelumnya, 100 µg/mL adalah dosis yang dipilih untuk diterapkan dalam percobaan penuaan. Kandungan ROS intraseluler diukur dengan menggunakan DCFDA dan, tingkat mitokondria, melalui pewarna Mitotracker. Salah satu karakteristik penuaan adalah peningkatan produksi ROS, yang menyebabkan peningkatan kerusakan oksidatif (Korovesis et al. 2023 ). Di sini, efek terkait usia dalam kandungan ROS intraseluler dan mitokondria ditunjukkan, mengamati nilai yang lebih tinggi pada cacing tua dari kelompok CTL dibandingkan dengan rekan-rekan mereka yang lebih muda (Gambar 10A,C ). Pengobatan dengan 100 µg/mL GAR menghasilkan kadar ROS yang lebih rendah pada kedua parameter. Hal ini juga tercermin dalam panel titik yang diperoleh dari sitometer Biosorter (Gambar 10B,D ). Efek tersebut sejalan dengan kekuatan antioksidan yang diamati secara in vitro dan in vivo. Dalam situasi stres, baik yang disebabkan oleh paparan agen eksternal (AAPH) atau sebagai bagian dari proses penuaan alami, sifat antioksidan GAR yang nyata (atau potensinya sebagai modulator pensinyalan sel) menjadi jelas.
Kandungan lipofuscin digunakan secara luas dalam model C. elegans sebagai penanda untuk mengevaluasi rentang kesehatan dalam penuaan (J. Zhu et al. 2023 ). Ini dibentuk oleh residu lipid dan protein yang terikat silang karena proses oksidatif yang dikatalisis oleh besi, yang menunjukkan stres oksidatif dan penuaan. Akumulasi pigmen auto-fluoresensi ini diukur dari gambar yang diambil dengan filter biru dalam mikroskop epi-fluoresensi. Akumulasi lipofuscin yang disebabkan oleh usia terbukti. Namun, cacing yang diobati dengan GAR mencapai nilai yang lebih tinggi daripada kelompok CTL lama (Gambar 10E,F ). Penurunan regulasi faktor transkripsi DAF-16/FOXO dan gen hilirnya SOD-3 oleh GAR dapat menyebabkan peningkatan produk sampingan oksidatif ini dengan efek negatif. Efek GAR yang dijelaskan sebelumnya pada umur panjang dapat dikaitkan dengan hasil yang ditemukan untuk kandungan lipofuscin. Lebih jauh lagi, akumulasi lipofuscin dikaitkan dengan berbagai proses yang tidak terkait dengan ROS, termasuk penurunan fungsi lisosomal dan gangguan pada fagositosis dan autofagi. Akibatnya, proses-proses ini dapat mengalami perubahan pada cacing yang menua dan perubahan tersebut mungkin tidak dipengaruhi oleh GAR, yang menjelaskan efek yang diamati pada kandungan lipofuscin (Navarro-Hortal et al. 2024 ).
Meskipun hasil yang diperoleh menjanjikan dan membuka pintu bagi penyelidikan di masa mendatang, studi ini menyajikan keterbatasan dan kelemahan tertentu. Model tersebut, meskipun memiliki kesamaan dengan mamalia, tetap merupakan nematoda, yang dapat membatasi penerapan langsung temuan tersebut pada organisme tingkat tinggi. Oleh karena itu, sangat penting untuk melakukan eksperimen lebih lanjut menggunakan model mamalia sebelum melanjutkan ke uji klinis. Selain itu, mekanisme yang mendasari efek yang diamati belum sepenuhnya dijelaskan, karena jalur lain di luar yang dipelajari mungkin terlibat.
4 Kesimpulan
Ekstrak bawang putih yang diteliti dalam laporan ini kaya akan senyawa sulfur, yang menyoroti keberadaan senyawa lain seperti fenolik. Kapasitas antioksidan in vitro dan in vivo telah dibuktikan. Sifat non-toksik akut GAR patut diperhatikan, yang menawarkan profil keamanan yang menjanjikan untuk aplikasi terapeutik yang potensial. Namun, temuan kami mengungkapkan aspek bernuansa dalam skenario paparan jangka panjang, di mana tiga konsentrasi GAR menyebabkan penurunan tingkat kelangsungan hidup. Fenomena ini dikaitkan dengan interaksi rumit yang melibatkan nukleasi faktor transkripsi DAF-16/FOXO dan penurunan regulasi ekspresi gen SOD-3. Lebih jauh, kemampuannya untuk menghambat AChE telah dibuktikan secara in vitro dan, meskipun GAR tidak memodulasi kelumpuhan yang disebabkan oleh agregasi Aβ, ia menunjukkan efek perbaikan yang signifikan pada gangguan gerak yang terkait dengan proteotoksisitas tau. Hal ini dapat dikaitkan dengan efek yang ditemukan pada pewarnaan transgenik GFP, terutama terkait dengan peningkatan ekspresi gen HSP-16.2. Selain itu, penyelidikan awal terhadap proses penuaan mengungkapkan bahwa ekstrak tersebut berhasil menghambat akumulasi ROS intraseluler dan mitokondria pada cacing tua.
Secara keseluruhan, hasil dari penelitian ini memberikan wawasan berharga mengenai dampak ekstrak bawang putih yang beragam, khususnya dalam konteks penuaan dan proses neurodegeneratif. Penelitian ini menjadi dasar bagi penelitian lebih lanjut yang mengeksplorasi mekanisme molekuler rumit yang mendasari efek GAR dan penerapannya ke dalam intervensi terapeutik potensial untuk kondisi neurodegeneratif terkait usia.
Leave a Reply