Pengaruh Pengocokan Berkecepatan Tinggi terhadap Transfer Oksigen dalam Labu Kocok

ABSTRAK
Labu goyang sebagian besar digunakan dalam penyaringan dan tahap awal pengembangan proses bioteknologi. Namun, proses yang membutuhkan oksigen tidak dapat dengan mudah dilakukan dalam labu goyang, karena kapasitas transfer oksigen maksimum biasanya lebih kecil daripada dalam reaktor yang diaduk. Studi selama beberapa dekade terakhir menunjukkan bahwa frekuensi pengocokan adalah salah satu parameter kultivasi yang paling penting untuk meningkatkan pasokan oksigen secara berkelanjutan dalam bioreaktor yang digoyang secara orbital. Dalam studi ini — untuk pertama kalinya — prototipe pengocok orbital yang menyeimbangkan diri digunakan, yang mampu dioperasikan pada frekuensi pengocokan hingga 750 rpm pada diameter pengocokan 25 mm dan 600 rpm pada 50 mm. Kultur Kluyveromyces lactis dipantau dengan sistem TOM yang dimodifikasi untuk mengukur kapasitas transfer oksigen maksimum (OTR maks ) dan nilai k L a yang sesuai . Nilai k L a maksimum sebesar 650 h −1 (OTR maks = 135 mmol/L/h) dicapai pada volume pengisian 10 mL dalam labu goyang 250 mL yang terbuat dari kaca dengan sifat permukaan hidrofilik. Ini merupakan peningkatan sekitar 50%, dibandingkan dengan pengocok orbital komersial saat ini. Pengocok orbital berkecepatan tinggi yang baru menyediakan kemungkinan baru untuk aplikasi penyaringan dan pengembangan proses. Pengocok berkecepatan tinggi untuk pasokan oksigen yang ditingkatkan sangat bermanfaat pada diameter pengocok 25 mm, daripada pada 50 mm, meminimalkan dampak gaya sentrifugal yang tinggi pada sistem pengocok.

Singkatan
A
luas perpindahan massa volumetrik (m 2 /m 3 )
c O2,g
fraksi mol oksigen dalam fase gas (mmol/mmol)
RKT
laju transfer karbon dioksida (mmol/L/jam)
hari ke 0
diameter getaran (m)
k L
koefisien perpindahan massa sisi cair (m/h)
k L,massal
koefisien perpindahan massa sisi cair dari cairan curah (m/h)
k L,film
koefisien perpindahan massa sisi cair dari film cair (m/h)
k sebuah​
koefisien perpindahan massa volumetrik (h −1 )
O2 yang tinggi
kelarutan oksigen (mmol/L)
N
frekuensi getaran (h −1 )
OTR
laju transfer oksigen (mmol/L/jam)
OTR maks
kapasitas transfer oksigen maksimum (mmol/L/jam)
V L
volume cairan ( m3 )
1 Pendahuluan
Pasokan oksigen adalah parameter penting untuk proses biologi aerobik dan salah satu parameter peningkatan skala yang paling kritis [ 1 ]. Pasokan oksigen yang tidak mencukupi dapat menyebabkan berkurangnya aktivitas metabolisme dan dapat menyebabkan pembentukan produk sampingan anaerobik yang tidak diinginkan, berkurangnya kuantitas dan kualitas produk [ 2 ]. Oleh karena itu, konsumsi oksigen biasanya dipantau dalam proses aerobik di reaktor tangki pengaduk [ 3 ]. Ketersediaan oksigen dikontrol, misalnya dengan mengatur laju aerasi, kecepatan pengaduk, atau jenis pengaduk [ 1 ]. Metode lebih lanjut untuk meningkatkan ketersediaan oksigen mencakup peningkatan tekanan reaktor atau aerasi dengan udara yang diperkaya oksigen [ 4 – 6 ]. Namun, penyaringan dan optimalisasi media biasanya dilakukan dalam mikroplat yang dikocok dan labu goyang [ 7 , 8 ], di mana metode yang disebutkan di atas hanya dapat diterapkan sampai batas tertentu. Seringkali, terlalu sedikit perhatian diberikan pada pasokan oksigen. Hal ini dapat menyebabkan keputusan yang salah selama penyaringan yang tidak dapat diperbaiki nanti [ 3 , 9 ]. Untuk budidaya terguncang, ada beberapa pilihan untuk meningkatkan pasokan oksigen sebagai berikut: (1) labu goyang berbaffle untuk meningkatkan turbulensi dan area perpindahan massa, (2) pengurangan volume cairan, (3) peningkatan diameter reaktor, (4) peningkatan diameter pengocokan, atau (5) peningkatan frekuensi pengocokan. Namun, labu goyang berbaffle dapat mendorong kondisi pengocokan di luar fase. Dalam hal ini, kaldu kultur tidak dapat mengikuti gerakan pengocok lagi, yang pada gilirannya menyebabkan berkurangnya masukan daya dan perpindahan oksigen [ 10 ]. Selain itu, labu goyang berbaffle mengalami reproduktifitas rendah [ 9 ] dan dapat memicu pembentukan busa serta pembasahan dan penyumbatan penghalang steril dengan tetesan [ 11 ]. Pengurangan volume cairan atau peningkatan diameter reaktor, keduanya bertujuan untuk meningkatkan area perpindahan massa volumetrik. Namun, kedua metode tersebut terbatas, karena efek penguapan ditingkatkan [ 12 ]. Pendekatan lain baru-baru ini telah disajikan di mana cincin kaca konsentris dimasukkan di bagian bawah bejana kaca silinder digunakan untuk meningkatkan area perpindahan massa gas-cair [ 13 ]. Zhu et al. menyajikan pengenalan silinder berongga tetapi tertutup di tengah bioreaktor yang dikocok secara orbital untuk meningkatkan pencampuran dan k L a [ 14 , 15 ]. Meningkatkan diameter pengocokan atau frekuensi pengocokan adalah satu-satunya pilihan untuk meningkatkan perpindahan oksigen dari budidaya dalam labu goyang standar tanpa efek buruk pada budidaya. Namun, karena dampak diameter pengocokan relatif kecil [16 , 17 ], meningkatkan frekuensi guncangan tetap menjadi satu-satunya pilihan yang valid dan layak.

Selama beberapa dekade terakhir, banyak korelasi empiris dikembangkan yang menggambarkan koefisien perpindahan massa volumetrik ( k L a ) atau kapasitas perpindahan oksigen maksimum (OTR max ) dalam labu goyang sebagai fungsi dari parameter goyangan dan kultivasi yang krusial (volume cairan V L , diameter goyangan d 0 , frekuensi goyangan n , diameter labu goyang d ). Meier dkk. [ 17 ] meninjau korelasi ini dan memperoleh korelasi universal untuk labu goyang yang terbuat dari kaca dengan cairan dengan viskositas seperti air yang juga mencakup efek komposisi media. Namun, korelasi ini ditetapkan dalam ruang eksperimen < frekuensi goyangan 450 rpm dan, oleh karena itu, tidak dapat diekstrapolasi melampaui titik ini. Satu-satunya model mekanistik lengkap untuk suplai oksigen dalam labu goyang telah dikembangkan oleh Maier dan Büchs [ 18 ] dan Büchs dkk. [ 19 ].

Meskipun meningkatkan frekuensi pengocokan adalah cara terbaik untuk meningkatkan ketersediaan oksigen, opsi ini biasanya dibatasi oleh mesin pengocokan. Penyeimbangan berat manual pengocok orbital melelahkan dan secara umum tidak sempurna. Pada tahun 1970, Freedman [ 20 ] melaporkan pengocokan pada 800 rpm pada diameter pengocokan 1 in. (25,4 mm) dengan pengocok yang dimodifikasi secara dinamis untuk penyerapan oksigen dalam reaksi oksidasi sulfit. Namun, hingga saat ini, batas frekuensi pengocokan pabrikan biasanya 400 rpm pada 25 mm [ 21 – 23 ].

Dalam studi ini, prototipe pengocok orbital penyeimbang mandiri (Paten DE 102014111236) digunakan untuk menerapkan, sejauh pengetahuan kami, gaya sentrifugal tertinggi dan k La tertinggi dalam kultivasi labu goyang [ 24 ]. Kluyveromyces lactis dikultivasi hingga 750 rpm pada diameter goyang 25 mm dan hingga 600 rpm pada diameter goyang 50 mm. OTR maks ditentukan dengan perangkat T ransferrate O nline M onitoring (TOM) buatan dalam perusahaan [ 25 ] dan hasilnya dibandingkan dengan prediksi model mekanistik.

2 Bahan dan Metode
2.1 Media dan Budidaya
Dalam penelitian ini, K. lactis GG79 pKlac1 dikulturkan dalam medium YEP (medium Yeast Extract Peptone). Strain yeast disediakan oleh Institute for Molecular Biotechnology dari RWTH Aachen University (Jerman). Medium YEP kompleks terdiri dari 10 g/L ekstrak yeast (nomor lot 375233217, Roth), 20 g/L pepton/tripton (nomor lot: 435235212, Roth). pH disesuaikan menjadi 4,8 dengan KOH 5 M. Medium pra-kultur mengandung 20 g/L glukosa dan kultur utama mengandung 80 g/L glukosa sebagai sumber karbon. Sebelum dikulturkan, ampisilin ditambahkan hingga konsentrasi akhir 0,1 g/L. Untuk pra-kultur, V L = 10 mL medium diinokulasi dengan 25 µL krio-kultur yang mengandung 150 g/L gliserol. Pra-kultur dikultur dalam labu kocok RAMOS 250 mL semalaman pada suhu 30°C hingga OTR 50 mmol/L/jam tercapai dalam fase pertumbuhan eksponensial. Frekuensi pengocokan pra-kultur adalah n = 600 rpm pada d0 = diameter pengocokan 25 mm dan n = 500 rpm pada d0 = 50 mm . Kultur utama diinokulasi dengan kerapatan optik (OD 600 ) sebesar 0,3, jika tidak dinyatakan lain. Kultur utama dikultur pada suhu 30°C dalam labu kocok RAMOS 250 mL pada V L = 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, dan 60 mL. Kultur utama pada d0 = diameter pengocokan 25 mm dimulai pada n = 600 rpm hingga semua kultur meninggalkan fase pertumbuhan eksponensial. Frekuensi pengocokan kemudian ditingkatkan menjadi n = 750 rpm dan selanjutnya dikurangi secara bertahap setiap 100 menit. Kultur utama pada diameter pengocokan d0 = 50 mm dimulai pada n = 500 rpm hingga semua kultur meninggalkan fase pertumbuhan eksponensial. Frekuensi pengocokan kemudian ditingkatkan menjadi n = 600 rpm dan selanjutnya dikurangi secara bertahap setiap 100 menit (Gambar 1A, B dan S1 ).

2.2 Pengaturan Pengukuran
Laju transfer oksigen dari delapan kultivasi labu goyang paralel ditentukan dengan perangkat TOM ( Transferrate O nline Monitoring ) buatan dalam negeri [ 27 ] berdasarkan teknologi RAMOS menurut Anderlei et al. [ 25 ]. Dalam perangkat TOM, labu goyang (volume nominal 250 mL) diangin-anginkan pada aliran 10 smL/menit (11,1 mL/menit pada 30°C), sesuai dengan ventilasi dalam labu Erlenmeyer leher sempit 250 mL dengan sumbat kapas [ 28 ]. Labu goyang standar 250 mL dengan leher berulir digunakan. Tidak ada perubahan geometris yang dilakukan pada bagian labu yang bersentuhan dengan cairan yang berputar. Sensor oksigen elektrokimia digunakan untuk mengukur tekanan parsial oksigen di ruang kepala labu goyang. Dalam fase pengukuran berulang, aerasi dihentikan (aerasi 15 menit, fase pengukuran 5 menit). OTR dihitung dari kemiringan tekanan parsial oksigen selama fase pengukuran ini.

2.3 Pengocok Berkecepatan Tinggi
Pengocok orbital LS-X dari Adolf Kühner AG (Birsfelden, Swiss) digunakan untuk eksperimen pengocok orbital berkecepatan tinggi. Pengocok tersebut dimodifikasi bekerja sama dengan Institute of Mechanism Theory, Machine Dynamics and Robotics (IGMR) di Universitas RWTH Aachen. Pengocok tersebut dilengkapi dengan mekanisme penyeimbang otomatis yang dijelaskan dalam Paten DE 102014111236. Gaya yang tidak seimbang diminimalkan secara otomatis dan pasif (tanpa sumber energi atau sensor apa pun). Dengan demikian, frekuensi pengocok hingga 750 rpm pada diameter pengocok 25 mm dan 600 rpm pada diameter pengocok 50 mm dapat dicapai.

2.4 Perhitungan Luas Perpindahan Massa dan Kapasitas Perpindahan Oksigen Maksimum dengan Model Mekanistik
Area perpindahan massa antara fase gas dan fase cair dalam labu kocok dihitung menurut Büchs et al. [ 19 ]. Satu asumsi model adalah gerakan cairan tanpa gesekan pada dinding labu kocok. Oleh karena itu, model ini hanya berlaku untuk cairan kental seperti air. Viskositas kaldu kultur dalam penelitian ini tidak pernah melebihi 1,4 mPa s (ditentukan dengan rheometer pelat kerucut [PhysicaMCR301 Modular, Anton Paar]). Model ini membedakan antara area perpindahan massa dari cairan massal yang berputar dan area perpindahan massa yang terbentuk sebagai film cairan hidrofilik di dasar labu kocok dan dinding labu kocok. Ini dinamakan “model distribusi cairan” sebagai berikut. k L a dan OTR max dihitung menurut “model dua sub-reaktor” yang disajikan oleh Maier et al. [ 18 ] dan menggunakan model distribusi cairan menurut Büchs et al. [ 19 ]. Pendekatan ini membagi fase cair dalam labu goyang menjadi dua sub-reaktor. Cairan curah dimodelkan sebagai reaktor aerasi permukaan campuran ideal, menurut model yang diturunkan oleh Gnielinski [ 29 ]. Lapisan film cair pada dinding dan dasar labu goyang digambarkan sebagai reaktor film, menurut teori penetrasi Higbie [ 19 ]. “Model dua sub-reaktor” sepenuhnya mekanistik dan tidak memerlukan parameter yang sesuai, seperti yang umum untuk reaktor aerasi gelembung. Oleh karena itu, model ini dapat diterapkan untuk memprediksi nilai k La dan OTR maks pada frekuensi goncangan tinggi yang bukan bagian dari studi oleh Maier et al. [ 18 ]. Dalam studi ini, hanya labu kaca hidrofilik yang digunakan, di mana lapisan film cair terbentuk pada dinding kaca. Sebaliknya, untuk labu plastik, pembentukan lapisan film cair terhalang, karena sifat hidrofobisitas permukaan.

Persamaan umum untuk menghitung k L a dari OTR maks dan sebaliknya disajikan di bawah ini:

c O2,g(20,95%) adalah fraksi mol O2 ambien . Di ruang kepala labu goyang, fraksi mol O2 < 20,95% hadir karena penghalang steril atau aerasi aktif (dalam kasus ini 11,1 mL/menit untuk semua volume pengisian) membatasi pertukaran udara. Untuk memperhitungkan volume pengisian dan laju aerasi yang berbeda, nilai OTR maksimum yang diukur dalam penelitian ini dinormalisasi ke fraksi mol O2 sebesar 20,95% (maksimum teoritis pada aerasi kuat dengan udara ambien) menggunakan Persamaan ( 2 ).

Konsentrasi O2 dalam cairan diasumsikan mendekati 0 mmol/L dalam cairan massal dalam kondisi keterbatasan oksigen dan, dengan demikian, tidak terwakili dalam Persamaan ( 1 ) . Parameter dalam Tabel 1 digunakan untuk menghitung kLa dari data OTR maks yang diukur dan OTR maks dari nilai kLa yang diperoleh dari model .

TABEL 1. Parameter masukan untuk model mekanistik dan perhitungan k _L a .

3 Hasil
3.1 Kapasitas Transfer Oksigen Maksimum pada Frekuensi Pengocokan Tinggi yang Diperoleh dari Budidaya dengan Oksigen Terbatas
Efek dari frekuensi pengocokan yang tinggi pada transfer oksigen selama kultur labu goyang dianalisis selama kultur ragi K. lactis . Dalam percobaan awal, K. lactis menunjukkan fase pertumbuhan yang cepat dan eksponensial pada konsentrasi glukosa 80 g/L dalam medium YEP. Setelah mencapai keterbatasan oksigen, respirasi terbatas oksigen terus-menerus diamati selama beberapa jam ( d0 = 25 mm, VL = 10 mL, n = 600 rpm, OTR ≈ 100 mmol/L/jam, keterbatasan oksigen 12 jam, data tidak ditampilkan), tanpa dipengaruhi oleh ko-substrat pembatas, perubahan pH, produk penghambat atau produk sampingan. Oleh karena itu, fase pertumbuhan terbatas oksigen ini dianggap cocok untuk menyelidiki kLa dan OTR maks . Flitsch dkk. [ 32 ] sebelumnya telah menyajikan data respirasi untuk kultur K. lactis terbatas oksigen yang tumbuh dalam kondisi serupa pada 40 g/L glukosa dalam medium YEP. Gambar 1A,B menyajikan jalannya OTR selama kultur K. lactis dengan volume pengisian berkisar antara 10 hingga 60 mL pada d0 = 25 mm (A) dan d0 = 50 mm (B). Fase awal kultur dilakukan pada 600 rpm ( d0 = 25 mm ) dan 500 rpm ( d0 = 50 mm). Pada bagian awal kultur ini, kultur mulai tumbuh secara eksponensial, diikuti oleh keterbatasan oksigen (volume pengisian 15–60 mL) atau baru saja meninggalkan fase pertumbuhan eksponensial (10 mL). Semakin tinggi volume pengisian, semakin awal keterbatasan oksigen terjadi dan semakin rendah OTR selama keterbatasan oksigen. Setelah fase pertumbuhan awal ini, frekuensi pengocokan ditingkatkan hingga maksimum yang memungkinkan, 750 rpm ( d0 = 25 mm) dan 600 rpm ( d0 = 50 mm). Selanjutnya, frekuensi pengocokan diturunkan secara bertahap setiap 100 menit, yang mengakibatkan pasokan oksigen semakin sedikit. Dengan cara ini, kultur tetap dibatasi oksigennya selama seluruh proses budidaya. Jelas, dataran tinggi OTR yang dapat dibedakan terbentuk pada setiap frekuensi pengocokan. Empat nilai OTR terakhir yang diukur di dataran tinggi dari setiap langkah frekuensi pengocokan dirata-ratakan dan nilai k La dan OTR maks yang sesuai dihitung ( OTR maks adalah OTR yang sesuai pada oksigen 20,95%). Perhitungan yang sama dilakukan untuk data dari percobaan individu lain (digambarkan dalam Gambar S1 ). Nilai dari kedua percobaan individu hanya menunjukkan penyimpangan kecil. Gambar 1C,Dmerangkum hasil dari perhitungan untuk frekuensi pengocokan, diameter pengocokan, dan volume pengisian yang berbeda. k L a maksimum yang dicapai dalam penelitian ini adalah 650 h −1 pada n = 750 rpm, d 0 = 25 mm, dan V L = 10 mL (masing-masing OTR maks = 135 mmol/L/h). Ini sekitar 50% lebih tinggi daripada yang mungkin dilakukan dengan mesin pengocokan komersial. Ini dalam kisaran yang sama dengan nilai k L a yang dicapai dengan banyak bioreaktor tangki pengaduk sekali pakai untuk skala lab dan pilot [ 33 ]. Laju transfer oksigen yang serupa dalam kultivasi labu goyang hanya ditunjukkan oleh Hansen et al. [ 13 ] , menggunakan bejana silinder dengan cincin kaca yang disisipkan secara konsentris untuk meningkatkan luas permukaan film cairan.

Pada d 0 = 50 mm, OTR maks (masing-masing k La ) meningkat tajam hingga 300 rpm. Di atas 300 rpm, peningkatan OTR maks cenderung melambat, sedangkan untuk d 0 = 25 mm korelasi antara OTR maks dan frekuensi pengocokan menunjukkan perilaku yang mendekati linier. OTR maks meningkat seiring dengan penurunan volume pengisian seperti yang ditemukan pada banyak korelasi sebelumnya [ 17 ]. Sumbu X atas menunjukkan angka Froude (Fr) sebagai parameter, yang mewakili gaya sentrifugal yang diterapkan pada labu pengocokan (lihat Persamaan 2 ).

Angka Froude tertinggi yang dicapai selama penelitian ini kira-kira 10 pada d0 = 50 mm, yang berkorelasi dengan gaya sentrifugal 10 × g . Mekanisme penyeimbang diri dari prototipe pengocok orbital memungkinkan frekuensi goncangan dan gaya sentrifugal yang sesuai yang belum dilaporkan sejauh ini pada diameter goncangan 50 mm. Namun, k L a tertinggi yang ditentukan adalah 650 h −1 pada 750 rpm dan d0 = 25 mm (angka Froude = 7,86).

Peter et al. [ 34 ] menyarankan angka Reynolds kritis sebesar 60.000 untuk transisi antara aliran laminar dan turbulen dalam labu goyang. Dalam studi terkini ini, angka Reynolds maksimum sebesar sekitar 64.500 pada d 0 = 25 mm dan 750 rpm tercapai dan sekitar 51.600 pada d 0 = 50 mm dan 600 rpm. Dalam pengocok inkubator yang tersedia secara komersial, angka Reynolds yang tinggi tersebut hanya dapat dicapai dalam labu dengan volume nominal 500 mL atau lebih besar.

3.2 Model Prediksi k L a
Data OTR maks dan k L a yang diperoleh dari budidaya K. lactis yang terbatas oksigen (Gambar 1C,D ) dibandingkan dengan nilai OTR maks dan k L a yang diprediksi dari model dua sub-reaktor mekanistik, yang disajikan oleh Maier et al. [ 18 ], dikombinasikan dengan model distribusi cairan oleh Büchs et al. [ 19 ]. k L a yang diprediksi oleh model adalah komposit dari koefisien perpindahan massa sisi cairan k L dan luas perpindahan massa volumetrik a , yang dihitung secara terpisah untuk cairan massal yang berputar dan lapisan cairan pada dinding labu.

3.3 Total Luas Perpindahan Massa
Total area perpindahan massa dibagi menjadi area cairan massal dan area film cairan yang terbentuk pada dinding kaca selama pengocokan. Total area perpindahan massa yang dihitung dari model distribusi cairan oleh Büchs et al. [ 19 ] disajikan dalam Gambar S2 . Ini bergerak secara asimtotik ke maksimum dengan meningkatnya frekuensi pengocokan, karena bentuk kerucut dari labu goyang. Ketinggian cairan maksimum tercapai, ketika cairan massal membentuk antarmuka vertikal ke ruang kepala labu. Sebaliknya, dalam bejana silinder, area perpindahan massa akan terus meningkat dengan meningkatnya gaya sentrifugal. Temuan ini sebelumnya disebutkan oleh Maier [ 35 ]. Kondisi eksperimen dalam penelitian ini (pada d0 = 25 mm dan 750 rpm dan pada d0 = 50 mm dan 600 rpm) menyebabkan total area perpindahan massa yang dihitung hanya 4% lebih sedikit dari maksimum teoritis (2000 rpm digunakan sebagai batas atas untuk perhitungan). Menurut perhitungan ini, frekuensi goncangan di atas 400 rpm hanya menyebabkan peningkatan minor pada area perpindahan massa (sekitar 15% peningkatan dari 400 hingga 750 rpm pada d 0 = 25 mm). Peningkatan pada total area perpindahan massa volumetrik ini terutama dapat dikaitkan dengan peningkatan pada area film cair karena area cairan massal tetap agak konstan dalam rentang simulasi (lihat Gambar S3 ). Ketika total area perpindahan massa mendekati maksimumnya (di atas 400 rpm), koefisien perpindahan massa k L dari cairan massal ( k L,bulk ) dan film cair ( k L,film ) serta distribusi cairan (distribusi antara area cairan massal dan area film cair) harus menjadi alasan untuk meningkatkan nilai k L a pada peningkatan frekuensi goncangan.

3.4 Distribusi Cairan dan Nilai k L
Gambar 2 secara contoh menunjukkan distribusi cairan terhitung untuk kedua diameter pengocokan pada n = 600 dan V L = 50 mL. Area antara garis merah, garis biru, dan dinding labu di sisi kanan menandai cairan curah, sedangkan area putus-putus mewakili dinding kaca labu goyang yang ditutupi dengan lapisan cairan. Untuk d 0 = 50 mm, dibandingkan dengan d 0 = 25 mm, tinggi cairan maksimum pada 600 rpm lebih tinggi dan cairan curah menutupi sudut perimeter labu yang jauh lebih kecil. Pola distribusi cairan ini ditemukan untuk seluruh rentang simulasi frekuensi pengocokan (100–800 rpm) dan volume pengisian (10–60 mL) dan disebabkan oleh gaya sentrifugal yang lebih tinggi dan pusat gerakan pengocokan orbital yang lebih bergeser relatif terhadap pusat labu pada d 0 = 50 mm, dibandingkan dengan d 0 = 25 mm (lihat tanda silang hitam pada Gambar 2C,D ). Ketinggian cairan yang lebih tinggi pada d0 = 50 mm menjelaskan luas total perpindahan massa yang lebih besar (cairan curah + lapisan cairan) pada d0 = 50 mm . Namun, distribusi luas perpindahan massa (lihat Gambar S3 ) menunjukkan bahwa hanya luas lapisan cairan yang lebih besar pada d0 = 50 mm, sedangkan luas cairan curah lebih besar untuk d0 = 25 mm.

Menurut dua model sub-reaktor oleh Maier et al. [ 18 ], koefisien perpindahan massa untuk cairan massal ( k L,bulk ) meningkat hampir proporsional dengan frekuensi pengocokan, sementara korelasinya sub-proporsional untuk film cair ( k L,film ) (lihat Gambar S4 ). Untuk keduanya, k L,bulk dan k L,film , tidak ada perbedaan besar yang diprediksi oleh dua model sub-reaktor antara d 0 = 25 mm dan d 0 = 50 mm, yang menunjukkan bahwa diameter pengocokan lebih rendah dari nilai k L , dibandingkan dengan frekuensi pengocokan. Untuk semua frekuensi pengocokan yang disimulasikan untuk studi ini, k L,film selalu lebih besar dari k L,bulk , yang mendukung pentingnya film cair untuk perpindahan massa [ 36 ].

Singkatnya, luas cairan curah, luas lapisan film cairan, dan k L,film meningkat secara sub-proporsional dengan frekuensi pengocokan, sedangkan k L,bulk meningkat secara kuasi-proporsional dengan frekuensi pengocokan. Akibatnya, total k L a yang dihasilkan , yang diprediksi oleh model dua sub-reaktor harus mengikuti tren sub-proporsional dengan frekuensi pengocokan (lihat Persamaan 3 ).

Dalam literatur, koefisien model empiris untuk memperkirakan k L a sebagai fungsi frekuensi goncangan (selain parameter lain) biasanya di atas atau sama dengan 1, misalnya, k L a ∼ n 1 [ 37 ], k L a ∼ n 1,16 [ 16 ], k L a ∼ n 1,18-Osmol/10,1 [ 17 ] ( n 1,081 untuk 1 osmol/kg). Liu et al. [ 38 ] adalah satu-satunya yang menyarankan korelasi sub-proporsional ( k L a ∼ n 0,88 ). Namun, ruang eksperimen Liu et al. dibatasi pada n = 200 rpm dan n = 250 rpm pada d 0 = 25 mm [ 38 ]. Oleh karena itu, saturasi dalam area perpindahan massa tidak dapat menjadi alasan untuk temuan mereka. Akan tetapi, belum ada model empiris yang dikembangkan dengan kumpulan data yang melebihi n = 450 rpm dan, oleh karena itu, tidak dapat diekstrapolasi melampaui frekuensi guncangan ini.

3.5 Pengaruh Angka Froude dan Diameter Pengocokan terhadap Transfer Oksigen dan Distribusi Cairan
Gambar 3 mengilustrasikan OTR maks dan k La sebagai fungsi dari bilangan Froude untuk d 0 = 25 mm dan d 0 = 50 mm. Data yang disajikan dalam Gambar 3 diperoleh dari kumpulan data eksperimen yang ditunjukkan dalam Gambar 1 dan S1 . Hanya tiga volume pengisian yang berbeda yang ditunjukkan untuk kejelasan gambar. Bilangan Froude mewujudkan gaya sentrifugal yang bekerja pada labu goyang dan seluruh sistem goyang. Mesin goyang yang tidak diseimbangkan dengan hati-hati menunjukkan getaran yang lebih kuat dan keausan mekanis pada tingkat gaya sentrifugal yang tinggi. Oleh karena itu, lebih baik untuk menjalankan pengocok pada bilangan Froude yang rendah, jika berlaku. Ketika bilangan Froude yang sama (gaya sentrifugal yang sama) diterapkan pada d 0 = 25 mm dan d 0 = 50 mm, kapasitas transfer oksigen maksimum lebih tinggi pada d 0 = 25 mm (lihat Gambar 3 ) dalam seluruh rentang eksperimen studi ini (100–750 rpm). Kesimpulan ini sudah dapat ditarik dari korelasi k L a saat ini [ 16 , 17 ] hingga 450 rpm dan telah ditunjukkan secara eksperimental oleh Akgün et al. [ 39 ] untuk frekuensi guncangan hingga 325 rpm.

Korelasi antara perpindahan oksigen dan angka Froude jelas subproporsional untuk kedua diameter goncangan. Oleh karena itu, peningkatan perpindahan oksigen semakin kecil pada angka Froude yang lebih tinggi. Gambar S5 menyajikan distribusi cairan pada Fr = 7,86 (ditandai sebagai garis putus-putus vertikal pada Gambar 3 ) sebagai contoh untuk volume pengisian 50 mL. Sementara gaya sentrifugal sama dalam kedua kasus ( d0 = 25 mm dan d0 = 50 mm), distribusi cairan sangat berbeda. Ketinggian cairan dan, akibatnya, total luas perpindahan massa sedikit lebih besar untuk d0 = 50 mm. Pada d0 = 25, luas lapisan cairan meliputi sekitar 60% (40% luas cairan massal ) dari total luas perpindahan massa sementara pada d0 = 50 lapisan cairan meliputi sekitar 70% (30% luas massal) (bandingkan lingkaran padat [ d0 = 25 mm] dan putus-putus [ d0 = 50 mm] pada Gambar S3B ). Dengan menerapkan gaya sentrifugal yang sama, kecepatan superfisial cairan yang berputar lebih tinggi pada d0 = 25 mm daripada pada d0 = 50 ( dalam kasus ini 750 rpm dibandingkan dengan 530 rpm). Dengan demikian, pada d0 = 25 mm, pemulihan lapisan cairan terjadi lebih sering, waktu kontak antara lapisan cairan dan ruang kepala lebih pendek dan koefisien perpindahan massa kL dari cairan massal dan lapisan cairan lebih tinggi karena kecepatan superfisial yang lebih tinggi (bandingkan lingkaran padat [ d0 = 25 mm] dan putus-putus [ d0 = 50 mm] pada Gambar S4B ).

Untuk meminimalkan tekanan mekanis pada mesin pengocok atau meningkatkan transfer oksigen pada tekanan mekanis yang sama, diameter pengocok yang kecil dapat direkomendasikan. Namun, ketika memilih diameter pengocok yang lebih kecil, perlu diperhatikan bahwa hal ini dapat mendukung kondisi operasi di luar fase, terutama untuk kaldu kultivasi yang kental [ 40 ].

3.6 Perbandingan Data Model dan Hasil Eksperimen
Gambar 4 membandingkan OTR maks dan k L a yang diprediksi model (dua model sub-reaktor [ 18 ]) dan OTR maks dan k L a yang diukur secara eksperimen , yang diperoleh dari kumpulan data pada Gambar 1 dan S1 . Untuk d 0 = 25 mm, transfer oksigen yang diukur diprediksi dengan baik oleh model (garis padat) untuk mengisi volume hingga 25 mL (Gambar 4A,C ). Untuk mengisi volume dari 30 hingga 60 mL, nilai eksperimen mengikuti tren yang lebih linier daripada sub-proporsional yang mengarah ke penyimpangan dari nilai prediksi model di atas frekuensi pengocokan 500 rpm (titik data biru muda dan oranye pada Gambar 4A , titik data merah muda dan kaki pada Gambar 4C ). Untuk d 0 = 50 mm, model memprediksi dengan baik peningkatan sub-proporsional dalam transfer oksigen dengan meningkatnya frekuensi pengocokan (Gambar 4B,D ).

Kualitas prediksi secara umum luar biasa, karena model sepenuhnya mekanistik dan tidak menggunakan parameter pemasangan apa pun untuk diadaptasi. Plot paritas OTR maks yang dimodelkan dan diukur pada Gambar 5 menunjukkan bahwa kesalahan sebagian besar < ± 20%. Kemungkinan alasan untuk penyimpangan parsial antara data prediksi model dan data eksperimen (volume pengisian antara 30 dan 60 mL pada d 0 = 25 mm) harus dibahas secara singkat. Kaldu kultivasi dalam penelitian ini mempertahankan viskositas sekitar 1,4 mPa s selama kultivasi. Ottow et al. [ 41 ] serta Azizan dan Büchs [ 42 ] telah menunjukkan bahwa gesekan pada viskositas seperti air menyebabkan distribusi cairan yang sedikit tidak simetris, yang tidak diperhitungkan oleh model distribusi cairan [ 19 ]. Temuan mereka didukung oleh studi CFD yang dilakukan oleh Dinter et al. [ 43 , 44 ]. Oleh karena itu, distribusi cairan mungkin menjadi salah satu alasan penyimpangan antara data prediksi model dan data eksperimen dalam beberapa kondisi. Selain itu, kelarutan oksigen dan difusivitas oksigen adalah parameter input model [ 18 ]. Ini diperkirakan menurut literatur terkini, berdasarkan komposisi media dan suhu [ 26 , 30 , 31 ]. Perubahan komposisi media dapat memengaruhi parameter ini (seperti yang disarankan oleh Flitsch et al. [ 32 ]) tetapi tidak dipertimbangkan dalam penelitian ini. Namun, kemajuan kultivasi sangat mirip untuk kedua diameter pengocokan (bandingkan Gambar 1A,C ). Oleh karena itu, hasil perbandingan antara d0 = 25 mm dan d0 = 50 mm seharusnya tidak terpengaruh. Investigasi lebih lanjut tentang deviasi antara model dan data eksperimen pada frekuensi pengocokan tinggi dan volume pengisian tinggi harus dilakukan dalam penelitian mendatang.

4 Kesimpulan
Kultur labu goyang K. lactis yang membutuhkan oksigen telah berhasil dilakukan pada prototipe pengocok orbital berkecepatan tinggi baru pada diameter goyang 25 dan 50 mm. K L a maksimum 650 h −1 (OTR maks = 135 mmol/L/h) pada volume pengisian 10 mL dalam labu goyang 250 mL pada diameter goyang 25 mm dan 750 rpm tercapai. Temuan eksperimen dalam studi ini menunjukkan korelasi yang sedikit sub-proporsional antara frekuensi goyang, k L a , dan OTR maks masing-masing pada frekuensi goyang hingga 750 rpm, sementara korelasi empiris saat ini (berkisar hingga 450 rpm) menunjukkan korelasi yang terlalu proporsional. Model dua sub-reaktor mekanistik yang disajikan oleh Maier et al. [ 18 ], menggunakan model distribusi cairan yang disajikan oleh Büchs et al. [ 19 ], menggambarkan dengan baik hubungan yang diamati secara eksperimental antara perpindahan oksigen dan frekuensi pengocokan, karena mempertimbangkan saturasi dalam area perpindahan massa dan peningkatan sub-proporsional dalam koefisien perpindahan massa sisi cair ( k L , film ) dari film cair yang terbentuk pada dinding labu goyang hidrofilik. Namun, untuk diameter pengocokan yang lebih kecil sebesar 25 mm, k L a sedikit diremehkan pada volume pengisian tinggi (30–60 mL). Di masa mendatang, perbandingan temuan ini dengan hasil dari analisis CFD harus dilakukan. Ditemukan bahwa k L a dan OTR maks masing-masing selalu lebih tinggi pada d 0 = 25 mm dibandingkan dengan d 0 = 50 mm, jika angka Froude yang sama diterapkan. Untuk proses yang membutuhkan oksigen, diameter pengocokan yang lebih kecil mungkin merupakan trade-off yang lebih baik antara pasokan oksigen dan getaran serta keausan mesin.

Pengocokan berkecepatan tinggi dapat meningkatkan k L a secara substansial dalam labu kocok, dibandingkan dengan mesin pengocok yang tersedia saat ini. K L a ditingkatkan tanpa memerlukan prosedur eksperimen khusus, seperti pengayaan oksigen, perubahan bentuk labu kocok, pengisian volume yang sangat rendah, atau penggunaan labu besar. Oleh karena itu, untuk aplikasi dalam industri dan penelitian, komersialisasi prototipe pengocok orbital berkecepatan tinggi yang digunakan akan lebih diinginkan. Penanganan yang aman serta penjepitan labu yang kuat dan mudah digunakan harus diperhatikan dalam pekerjaan mendatang.

Nilai K L a yang dilaporkan dalam penelitian ini mendekati nilai pada skala industri dan bioreaktor pengaduk sekali pakai [ 1 , 13 , 33 ], sedangkan bioreaktor miniaturisasi masih dapat mencapai k L a yang jauh lebih tinggi [ 1 ].

Untuk sepenuhnya menutup kesenjangan antara tingkat pasokan oksigen dalam labu goyang dan bioreaktor berpengaduk, kombinasi beberapa konsep berbeda mungkin merupakan strategi yang layak, misalnya pengocokan berkecepatan tinggi dikombinasikan dengan interior dinding konsentris [ 13 ] dan pengayaan oksigen.