ABSTRAK
Gangguan kognitif sering menyertai epilepsi lobus temporal (TLE), yang terkait dengan stres oksidatif. Bubuk brokoli kering beku (BROC) menunjukkan beragam aktivitas biologis, khususnya sifat antioksidannya. Studi kami mengeksplorasi efek BROC pada fungsi kognitif pascaepilepsi. Tikus jantan dengan epilepsi yang diinduksi litium-pilokarpin dibagi secara acak menjadi tiga kelompok: kelompok kontrol, kelompok model (diet basal), dan kelompok intervensi brokoli (diet basal yang disuplemen dengan 4% BROC). Setelah 60 hari intervensi, fungsi kognitif dievaluasi menggunakan IntelliCage Learning Tests, Novel Object Recognition, dan Shuttle Box Tests. Kadar malondialdehid (MDA) hipokampus dan aktivitas enzim antioksidan diukur, dan kadar ekspresi protein HO-1, NQO1, dan Nrf2 dianalisis dengan Western blot. Hasilnya menunjukkan bahwa intervensi brokoli secara signifikan memperbaiki defisit kognitif pada tikus epilepsi, menurunkan kadar MDA hipokampus sekaligus meningkatkan aktivitas enzim antioksidan, dan meningkatkan ekspresi HO-1, NQO1, dan Nrf2. Akibatnya, BROC secara efektif melemahkan OS dan memperbaiki defisit kognitif pada tikus TLE, yang menunjukkan nilai terapeutik potensialnya untuk disfungsi kognitif pascaepilepsi.
1 Pendahuluan
Epilepsi lobus temporal (TLE), yang merupakan salah satu bentuk epilepsi yang paling umum, sebagian besar ditandai oleh resistensi obat dan sangat terkait dengan disfungsi kognitif yang parah (Phuong et al. 2021). Fungsi kognitif, termasuk kemampuan eksekutif, belajar, dan memori, sangat penting untuk kualitas hidup. Meskipun obat antiepilepsi saat ini menunjukkan kemanjuran dalam pengendalian kejang, obat tersebut menunjukkan manfaat terapeutik yang terbatas dalam mengatasi defisit kognitif yang terkait dengan gangguan tersebut (Postnikova et al. 2019; Rodriguez-Cruces et al. 2022).
Model epilepsi yang diinduksi litium-pilokarpin pada tikus merupakan paradigma eksperimental yang mapan yang secara efektif mereplikasi status epileptikus manusia. Model ini dibedakan dengan reproduksi akurat berbagai fitur patologis, termasuk kejang berulang spontan, perubahan perilaku, ketidakteraturan elektroensefalografi, dan manifestasi neuropatologis. Yang terpenting, model ini mencerminkan defisit kognitif yang sering terlihat pada epilepsi kronis. Meskipun banyak pasien epilepsi dapat mengelola kejang mereka dengan obat-obatan, kapasitas obat-obatan ini untuk meningkatkan fungsi kognitif masih belum jelas. Keterbatasan ini menekankan kebutuhan penting untuk menyelidiki dan mengembangkan strategi terapi yang menawarkan profil keamanan yang ditingkatkan dan kemanjuran yang lebih baik dalam mengatasi defisit kognitif dan meringankan beban pasien (Ahmed Juvale dan Che Has 2020).
Stres oksidatif (OS) merupakan tantangan patofisiologis yang terus-menerus selama perkembangan epilepsi. Spesies oksigen reaktif (ROS) yang berlebihan dalam tubuh dapat menyebabkan stres oksidatif, yang menyebabkan potensi kerusakan saraf dan gangguan kognitif (Teleanu et al. 2022). Malondialdehid (MDA) dan glutathione peroksidase (GSH-Px) secara luas dikenal sebagai penanda stres oksidatif. Dalam kondisi stres oksidatif, kadar protein antioksidan seperti quinone oxidoreductase 1 (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1), glutathione peroxidase 1 (GSH-Px1), dan glutathione S-transferase M1 (GSTm1) menunjukkan penurunan regulasi yang signifikan, sementara kadar MDA cenderung meningkat (Detcheverry et al. 2023; Mohideen et al. 2023). Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) merupakan faktor antioksidan intrinsik esensial yang memainkan peran penting dalam melindungi terhadap kerusakan oksidatif melalui jalur pensinyalan elemen respons antioksidan (ARE) Nrf2 (W. Wang et al. 2013). Penurunan ekspresi Nrf2 selanjutnya dapat memperburuk neuroinflamasi dan apoptosis (Bhowmick et al. 2019). Oleh karena itu, pemeliharaan homeostasis redoks muncul sebagai target terapi penting untuk mengurangi neuroinflamasi terkait epilepsi.
Brokoli, sayuran silangan, mengandung banyak fitokimia, termasuk senyawa fenolik, sulfida organik, karotenoid, mineral, dan vitamin (Ramirez et al. 2020). Penelitian telah menjelaskan bahwa metode pemrosesan yang berbeda secara nyata memengaruhi konsentrasi zat bioaktif dalam brokoli. Khususnya, brokoli yang dikeringkan dengan beku menunjukkan komposisi nutrisi dan retensi aktivitas antioksidan yang lebih unggul dibandingkan dengan olahan yang dikeringkan dengan udara konvensional (Kim et al. 2021; Mohammadi et al. 2020; Sharma et al. 2011). Konstituen bioaktif ini memberikan banyak sifat terapeutik, termasuk sifat antioksidan, antiinflamasi, antikarsinogenik, dan sitoprotektif (Mandrich dan Caputo 2020; Raiola et al. 2017). Selain itu, bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa senyawa yang berasal dari brokoli, khususnya sulforafan, mengaktifkan jalur pensinyalan Nrf2-ARE, sehingga meningkatkan kadar enzim antioksidan seperti GSH-Px, katalase (CAT), dan superoksida dismutase (SOD) yang pada akhirnya meningkatkan mekanisme pertahanan antioksidan seluler (Ruhee dan Suzuki 2020; Zhang et al. 2023a). Namun, potensi terapeutik brokoli dalam memperbaiki gangguan kognitif pada tikus epilepsi yang diinduksi litium-pilokarpin dan efek antioksidannya pada jaringan hipokampus masih harus dijelaskan sepenuhnya. Oleh karena itu, tujuan kami adalah untuk menyelidiki apakah bubuk brokoli kering beku (BROC) dapat melemahkan defisit memori kognitif dan pembelajaran, meningkatkan resistensi oksidatif hipokampus, dan memberikan efek neuroprotektif dalam model epilepsi eksperimental.
2 Bahan dan Metode
2.1 Reagen
Bubuk brokoli beku-kering, kultur akar berbulu Physalis angulata yang mengandung solasodine (kemurnian: ≥ 98%) dan atropin (kemurnian: ≥ 98,0%) bersumber dari Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, Missouri); litium klorida diperoleh dari Tianjin Haicheng Chemical Co. Ltd. (Tianjin, Tiongkok); kit uji MDA, GSH-Px, CAT, SOD, dan Total Antioxidant Capacity (T-AOC) diperoleh dari Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute; kit ekstraksi protein total dan kit ekstraksi protein nuklir diperoleh dari Nanjing KeyGen Biotech Co. Ltd. Semua reagen lainnya, dipastikan memiliki kemurnian tertinggi.
2.2 Komposisi Diet dan Persiapan Bubuk Brokoli Beku-Kering
Diet dasar terdiri dari bahan-bahan standar, termasuk jagung dari Cina Timur Laut, gandum, tepung ikan impor, tepung ayam, bungkil kedelai, minyak kedelai, natrium klorida, batu kapur, kalsium hidrogen fosfat, kolin klorida, metionina, vitamin A, vitamin D3, dl-α-tokoferil asetat, menadion natrium bisulfit, tiamin nitrat, riboflavin, piridoksin hidroklorida, sianokobalamin, nikotinamida, kalsium D-pantotenat, asam folat, D-biotin, tembaga klorida basa, besi sulfat, mangan sulfat, seng hidroksimetionina kelat, dan ragi selenium (komposisi terperinci dalam Tabel 1–4).
Brokoli dipanen pada hari ke-12 pertumbuhan (Lin et al. 2022; Mahn et al. 2022). Setelah dicuci dan dipotong-potong, brokoli dibekukan pada suhu -24°C selama 10 jam, diikuti dengan pengeringan beku dan penggilingan hingga menjadi bubuk. Bubuk brokoli yang dikeringkan beku kaya akan berbagai senyawa bioaktif, termasuk karotenoid, vitamin, asam folat, dan protein.
2.3 Hewan dan Perawatan
Tikus C57BL/6J sehat berusia delapan minggu diperoleh dari Pusat Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Ningxia, yang diberi kode hewan IACUC SCXK(Ning) 2017–0001. Tikus ditempatkan di lingkungan yang terkontrol dengan siklus terang-gelap 12 jam, dengan suhu konstan 22°C ± 2°C dan kelembapan 55% ± 15%. Mereka memiliki akses sepuasnya terhadap makanan dan air. Prosedur percobaan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Kedokteran Ningxia (Nomor Persetujuan NXMU2020-021) sesuai dengan pedoman Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari Institut Kesehatan Nasional. Semua upaya dilakukan untuk meminimalkan rasa sakit dan mengurangi jumlah hewan yang digunakan dalam penelitian.
Tikus jantan secara acak dimasukkan ke dalam salah satu dari tiga kelompok: kelompok kontrol, kelompok epilepsi (EP), dan kelompok intervensi brokoli (EP + BROC) (n = 10). Kelompok kontrol dan epilepsi menerima diet basal. Sebaliknya, kelompok intervensi brokoli diberikan diet basal yang diperkaya dengan tambahan 4% bubuk brokoli kering beku (BROC) untuk total periode intervensi 88 hari.
Pada awal percobaan, kelompok intervensi epilepsi dan brokoli menjalani induksi kejang lobus temporal, sedangkan kelompok kontrol menerima salin. Induksi TLE yang diinduksi oleh litium-pilokarpin terdiri dari pemberian litium klorida (130 mg/kg berat badan, i.p.) 18 jam sebelum injeksi pilokarpin. Untuk meminimalkan komplikasi selama fase kejang akut, atropin (1 mg/kg berat badan, i.p.) diberikan 30 menit sebelum injeksi pilokarpin untuk mengurangi efek samping kolinergik perifer yang terkait dengan kejang. Tikus ditimbang seminggu sekali, dan uji perilaku dilakukan pada hari ke-60 pascaperawatan. Garis waktu eksperimen ditunjukkan pada Gambar Setelah ini, tikus dikorbankan 5 hari setelah uji perilaku akhir untuk penilaian perhitungan rasio berat otak terhadap tubuh, penentuan uji enzimatik, dan analisis Western Blot.
2.4 Uji Perilaku
Uji perilaku tikus dilakukan di ruangan terisolasi dengan suhu terkontrol untuk meminimalkan stres pada hewan. Untuk pengenalan objek baru dan eksperimen kotak antar-jemput, kamera video ditempatkan secara strategis di area tengah pengaturan eksperimen dan dihubungkan langsung ke komputer.
2.4.1 Uji Pembelajaran IntelliCage
Sistem IntelliCage (TSE Systems GmbH, Jerman) terdiri dari empat ruangan yang terletak di sudut-sudut. Setiap ruangan dilengkapi dengan dua botol air dan antena untuk pembaca kartu, yang mendeteksi mikrocip yang tertanam di tikus segera setelah mereka memasuki ruangan. Untuk memudahkan tusukan hidung, sensor pemutus sinar inframerah diprogram untuk aktif atau tidak aktif. Mikrocip ditanamkan secara subkutan di tengkuk setiap tikus untuk memudahkan pemisahan data untuk identifikasi individu. Prosedur eksperimen diuraikan sebagai berikut:
Eksplorasi Bebas: Tikus diberi waktu 1 hari untuk menjelajahi lingkungan secara bebas dan membiasakan diri dengannya. Semua pintu tetap terbuka, dan semua botol air dibuat dapat diakses. Frekuensi kunjungan ke setiap sudut dan jumlah air yang dikonsumsi oleh setiap tikus didokumentasikan dengan cermat.
Pembelajaran tusuk hidung: Selama 6 hari, semua pintu tetap tertutup, dan tikus dipaksa untuk menjelajahi lubang tusuk hidung untuk mendapatkan air. Jumlah kunjungan ke setiap sudut oleh setiap tikus dicatat dengan cermat untuk memastikan preferensi sudut.
Pemadaman perilaku: Tikus diberi waktu sehari untuk eksplorasi tanpa batas untuk memadamkan perilaku yang dipelajari sebelumnya.
Pembelajaran Posisi Positif: Selama rentang waktu 6 hari, sudut yang paling tidak disukai untuk setiap tikus ditetapkan sebagai sudut yang “benar”, sedangkan sudut yang tersisa dianggap “salah.” Setelah eksplorasi lubang tusuk hidung, pintu dibuka untuk memungkinkan konsumsi air. Baik jumlah kunjungan yang benar maupun volume air yang dikonsumsi oleh setiap tikus dicatat dengan cermat untuk mengevaluasi kemampuan mereka dalam pembelajaran posisi positif.
Pembelajaran posisi terbalik: Selama periode 6 hari, sudut yang berseberangan secara diagonal dengan sudut yang sebelumnya ditetapkan sebagai sudut “benar” ditetapkan ulang sebagai sudut “benar” yang baru, sedangkan sudut yang tersisa ditetapkan sebagai sudut “salah” yang baru. Setelah eksplorasi lubang hidung, pintu dibuka untuk memungkinkan konsumsi air. Jumlah kunjungan yang benar dan volume air yang dikonsumsi oleh setiap tikus dicatat dengan cermat untuk menilai kemampuan mereka dalam pembelajaran posisi negatif.
Setelah menyelesaikan Uji Pembelajaran IntelliCage, semua tikus menjalani periode pencucian selama 5 hari.
2.4.2 Uji Pengenalan Objek Baru
Setelah Uji Pembelajaran IntelliCage, Uji Pengenalan Objek Baru (NOR) diterapkan pada tikus. Pada fase eksplorasi awal, tikus dihadapkan pada dua rangsangan yang identik. Selama fase penilaian diskriminatif yang terjadi setelahnya, salah satu rangsangan yang dikenal diganti dengan rangsangan yang tidak dikenal untuk menilai kemampuan pengenalan tikus. Tahap awal dimulai pada pukul 10:00 pagi, dengan tahap evaluasi dimulai pada pukul 2:00 siang, dengan demikian memastikan interval 4 jam antara kedua tahap. Kami dengan hati-hati mencatat jumlah waktu yang dihabiskan untuk memeriksa setiap objek, di samping Jarak di Zona–1 (objek lama), Jarak di Zona–2 (objek baru), Waktu di Zona (s)-1 (objek lama), dan Waktu di Zona (s)-2 (objek baru). Indeks pengenalan jarak (%) dihitung sebagai jarak yang ditempuh selama eksplorasi objek baru dibagi dengan total jarak yang ditempuh selama eksplorasi objek baru dan objek yang dikenal. Demikian pula, indeks pengenalan waktu (%) diperoleh dari durasi interaksi dengan objek baru selama total waktu interaksi dengan objek baru dan objek yang dikenal dikalikan dengan 100. Setelah menyelesaikan Uji Pengenalan Objek Baru, tikus diberi waktu istirahat selama 3 hari.
2.4.3 Uji Kotak Antar-Jemput
Setelah selesainya Uji Pengenalan Objek Baru, kami melanjutkan dengan Uji Kotak Antar-Jemput. Awalnya, kami menetapkan parameter eksperimen, yang meliputi periode aman (interval antara penyajian stimulus tak terkondisi dan stimulus terkondisi), durasi stimulus terkondisi (terdiri dari suara stabil frekuensi tinggi atau kilatan cahaya), durasi dan intensitas stimulus tak terkondisi (sengatan listrik), dan jumlah gerakan antar-jemput. Pada fase perolehan memori, tikus awalnya ditempatkan di ruang kiri, menghadap dinding ujung, dan dibiarkan beraklimatisasi selama 5 menit sebelum memulai percobaan. Sistem analisis video eksperimen Uji Kotak Antar-Jemput mengikuti prosedur tertentu. Awalnya, stimulus terkondisi yang berbeda disajikan dan dipertahankan selama durasi yang ditentukan. Jika tikus tetap berada di sisi yang sama, stimulus tak terkondisi diberikan. Selanjutnya, setelah menerima sengatan listrik, tikus bermigrasi dari lubang melingkar ke sisi yang berlawanan selama periode yang ditentukan, yang kemudian diikuti oleh penyajian stimulus terkondisi dan tak terkondisi di sisi yang berlawanan. Proses ini diulang. Selama fase pelatihan, setiap tikus terlibat dalam lusinan percobaan sehari selama tiga hari berturut-turut. Semua tikus mendapat satu hari libur, dan fase pengujian dilakukan pada hari kelima. Jumlah total respons menghindar dan melarikan diri, beserta durasi rata-rata respons ini (dalam detik), dicatat dengan saksama.
2.5 Rasio Berat Otak dan Tubuh
Setelah membius tikus, mereka ditimbang, dan otak mereka segera dikeluarkan dan dibilas dengan larutan garam fisiologis dingin
2. 6 Penentuan Uji Enzimatik
Untuk memperoleh sampel hipokampus dari tikus, jaringan diisolasi, dan homogenat jaringan 10% disiapkan menggunakan homogenizer jaringan. Supernatan kemudian dikumpulkan dengan cermat melalui sentrifugasi selama 5 menit pada suhu 4°C dan 12.000 rpm. Untuk pengujian, sampel uji dikombinasikan dengan larutan Coomassie Brilliant Blue G-250 untuk menginduksi perkembangan warna. Setelah pencampuran menyeluruh, absorbansi diukur pada 595 nm menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan konsentrasi protein dengan membandingkannya dengan kurva standar. Kadar malondialdehid (MDA) dan aktivitas glutathione peroksidase (GSH-Px), katalase (CAT), superoksida dismutase (SOD), dan total kapasitas antioksidan (T-AOC) di hipokampus diukur sesuai dengan protokol yang disediakan oleh masing-masing kit pengujian.
2.6.1 Kandungan MDA
Sistem reaksi disusun menggunakan homogenat jaringan hipokampus 10%. Sistem ini direndam dalam penangas air pada suhu 95°C selama 40 menit. Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi pada 3500–4000 rpm selama 10 menit. Penganalisis enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) digunakan untuk mengukur absorbansi supernatan yang dihasilkan pada 532 nm.
2.6.2 Aktivitas GSH-Px
Reaksi enzim diinkubasi dengan homogenat jaringan hipokampus 0,25% selama 15 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 412 nm menggunakan penganalisis enzyme immunoassay.
2.6.3 Aktivitas CAT
Sistem reaksi dibuat menggunakan homogenat jaringan hipokampus 10% (volume/volume). Absorbansi pada 405 nm diukur menggunakan penganalisis immunoassay terkait enzim.
Penilaian aktivitas OD (Kepadatan Optik) melibatkan pengenceran homogenat jaringan hipokampus hingga konsentrasi 0,25% dan menginkubasinya dengan substrat pada suhu 37°C selama 20 menit. Absorbansi kemudian diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan penganalisis immunoassay enzim.
2.7 Penentuan Kadar Protein
Kadar protein HO-1, NQO1, dan Nrf2 dinilai menggunakan analisis Western blot. Protein dari ekstrak utuh dan ekstrak inti diisolasi dari jaringan hipokampus tikus dan distandarisasi hingga konsentrasi protein 5 μg/μL. Sampel kemudian mengalami denaturasi dengan memanaskannya dalam penangas air selama 10 menit. Setelah denaturasi, protein dipisahkan melalui elektroforesis SDS-PAGE 10% pada tegangan tetap 100 V selama 1,5 jam, dan selanjutnya dipindahkan ke membran PVDF dalam tangki elektroforesis transfer pada tegangan tetap 25 V selama 1,5 jam dengan arus 125 mA. Untuk mengurangi interaksi nonspesifik, membran diblokir dengan susu skim 5% dalam TBST pada suhu 4 °C semalaman. Inkubasi dengan antibodi primer dilakukan pada suhu 37 °C selama 2 jam, diikuti dengan inkubasi pada suhu kamar selama 0,5 jam dengan antibodi sekunder. Pita protein divisualisasikan menggunakan deteksi fluoresensi, dan gambar selanjutnya dianalisis.
2.8 Penentuan Tingkat Ekspresi mRNA
Tingkat mRNA HO-1 dan NQO1 dalam total RNA dievaluasi menggunakan PCR kuantitatif waktu nyata. Total RNA diekstraksi, dan konsentrasi RNA dalam setiap sampel distandarisasi. Selanjutnya, mRNA ditranskripsi balik menjadi cDNA dengan β-aktin sebagai standar referensi internal, diikuti oleh amplifikasi PCR. Campuran amplifikasi terdiri dari 12,5 μL TB Green Premix Ex Taq II, 1 μL masing-masing primer maju dan mundur, 9,5 μL air bebas nuklease, dan 1 μL cDNA. Kondisi reaksi meliputi langkah denaturasi awal pada suhu 95°C selama 30 detik, diikuti oleh 40 siklus denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, pemanasan pada suhu 58°C selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik.
2.9 Analisis Statistik
Data parametrik dilaporkan sebagai rata-rata ± kesalahan baku rata-rata (SEM). Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS 24.0 untuk Windows (SPSS, Chicago, Illinois). Analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti oleh uji post hoc Student–Newman–Keuls (SNK) digunakan. Signifikansi statistik ditetapkan pada p < 0,05. 3 Hasil
3.1 Tanda, Penambahan Berat Badan, dan Rasio Berat Otak-Tubuh Sepanjang periode pengobatan, tidak ada tanda-tanda toksisitas yang nyata yang diamati pada tikus di semua kelompok. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar S1, tidak ada perbedaan signifikan dalam penambahan berat badan atau rasio berat otak-tubuh di antara kelompok-kelompok (p>0,05).
3.2 Bubuk Brokoli Beku-Kering Memperbaiki Disfungsi Kognitif yang Disebabkan oleh Epilepsi
Mengingat prevalensi gangguan kognitif sebagai komorbiditas klinis pada pasien dengan epilepsi, kami menilai dampak BROC pada kognisi menggunakan tiga tes perilaku: tes shuttle box dan tes pembelajaran IntelliCage. Tes pengenalan objek baru dirancang untuk mengevaluasi kemampuan eksplorasi, memori, dan pengenalan objek pada tikus. Ketika indeks pengenalan dihitung, baik berdasarkan jarak (Gambar 2A) atau waktu yang dihabiskan untuk menjelajahi objek (Gambar 2B), tikus epilepsi menunjukkan indeks pengenalan yang lebih rendah dibandingkan dengan tikus kontrol (p < 0,0001). Sebaliknya, tikus epilepsi yang diobati dengan BROC menunjukkan indeks pengenalan yang ja3.3 Bubuk Brokoli Beku-Kering Dapat Meningkatkan Kadar MDA dan Enzim Anti-Oksidatif di Hipokampus Tikus Epilepsi
MDA, produk akhir stabil dari peroksidasi lipid, berfungsi sebagai biomarker untuk menilai OS dalam berbagai sampel biologis. GSH-Px, CAT, SOD, dan T-AOC merupakan enzim antioksidan penting yang menunjukkan status antioksidan tubuh. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A,B, dibandingkan dengan kelompok kontrol, peningkatan kadar MDA yang signifikan (p < 0,0001) dan penurunan aktivitas GSH-Px yang nyata (p < 0,05) diamati di hipokampus tikus epilepsi. Sebaliknya, relatif terhadap tikus epilepsi yang tidak diobati, pengobatan BROC menyebabkan penurunan kadar MDA yang nyata (p < 0,0001) (Gambar 5A), peningkatan aktivitas GSH-Px yang signifikan (p < 0,01) (Gambar 5B), dan peningkatan aktivitas T-AOC (p < 0,05) (Gambar 5E) di hipokampus. Namun, tidak ada perubahan signifikan dalam aktivitas CAT dan SOD yang terdeteksi di antara kelompok-kelompok tersebut (p > 0,05) (Gambar 5C, D).
3.3 Bubuk Brokoli Beku-Kering Dapat Meningkatkan Aktivasi Faktor Transkripsi Nrf2 di Hipokampus Tikus Epilepsi
Kami memeriksa tingkat ekspresi faktor transkripsi nuklir Nrf2, serta tingkat transkripsi dan translasi dari dua enzim yang diatur Nrf2, HO-1 dan NQO1, di hipokampus. Seperti yang digambarkan pada Gambar 6A,B, pengobatan BROC meningkatkan kadar Nrf2 di hipokampus tikus epilepsi (p < 0,01), sementara tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara tikus epilepsi dan tikus kontrol (p > 0,05). Selain itu, pengobatan BROC meningkatkan kadar transkripsi HO-1 dan NQO1 dibandingkan dengan tikus epilepsi yang tidak diobati (masing-masing p < 0,01 dan p < 0,05) (Gambar 6C). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kadar ekspresi HO-1 dan NQO1 berkurang secara signifikan pada kelompok EP (p < 0,0001). Pengobatan BROC secara substansial meningkatkan kadar ekspresi kedua enzim ini pada tikus epilepsi yang tidak diobati (p < 0,0001) (Gambar 6E,F).
Kirim masukan Panel samping Histori Tersimpanuh lebih baik dibandingkan dengan tikus epilepsi yang tidak diobati (p < 0,0001).
4 Diskusi
Epilepsi lobus temporal (TLE) merupakan bentuk epilepsi refrakter yang paling umum. Studi klinis telah mengidentifikasi bahwa pasien TLE sering mengalami gangguan kognitif, karena kejang yang terus-menerus dan berulang menyebabkan disfungsi kronis pada sistem saraf pusat (Li et al. 2023). Yang terpenting, studi ini menekankan bahwa hubungan potensial antara pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) selama kejang dan stres oksidatif (OS) berikutnya telah dikaitkan secara signifikan dengan neuroinflamasi (Yakimov et al. 2023) dan disfungsi kognitif pascaepilepsi. Sayuran silangan, seperti brokoli, dikenal karena sifat antioksidan dan antiinflamasinya (Treasure et al. 2023), dan studi telah menunjukkan bahwa suplementasi bubuk brokoli dapat meningkatkan fungsi kognitif pada populasi lanjut usia dan remaja (Liu et al. 2024; Shirai et al. 2015). Sebagai makanan fungsional, brokoli mengandung berbagai senyawa bioaktif, dan pengeringan beku telah terbukti paling baik dalam menjaga aktivitas antioksidannya di antara berbagai metode pemrosesan (Xu et al. 2020). Oleh karena itu, kami memberikan 4% bubuk brokoli kering beku yang dicampur ke dalam pakan untuk tikus epilepsi selama 88 hari, yang diharapkan dapat memastikan kemanjuran antioksidan yang optimal sekaligus menghindari potensi toksisitas (Canene-Adams et al. 2013; Ma et al. 2022; Tomofuji et al. 2012). Kami menyajikan bukti yang menggarisbawahi efek menguntungkan dari bubuk brokoli kering beku pada gangguan kognitif pada model tikus epilepsi yang diinduksi litium-pilokarpin. Secara khusus, temuan kami mengungkapkan bahwa pengobatan ini meningkatkan kapasitas antioksidan hipokampus dan menunjukkan efek neuroprotektif yang signifikan, yang menunjukkan potensi BROC sebagai agen terapi tambahan untuk disfungsi kognitif pascaepilepsi. Model hewan status epileptikus pilokarpin yang diinduksi secara kimia adalah metode yang andal dan hemat biaya (Che Has 2023). Pilokarpin dapat mengaktifkan Reseptor Kolinergik, Muskarinik 1 (CHRM1), yang menyebabkan aktivasi reseptor NMDA hipokampus dan peningkatan eksitasi neuron glutamatergik (Niquet et al. 2023). Aplikasi sistemik pilokarpin pada tikus secara selektif menginduksi aktivitas epileptik dalam struktur sistem limbik, disertai dengan kejang motorik sesekali, status epileptikus sementara, dan kerusakan otak yang meluas, yang sangat mirip dengan status epileptikus persisten pada manusia (Turski et al. 1983). Lebih jauh, banyak penelitian telah menunjukkan bahwa hewan pengerat epileptik yang diinduksi pilokarpin-litium menunjukkan berbagai perubahan perilaku dan gangguan fungsi memori (Smolensky et al. 2019; Zubareva et al. 2023). Kami menggunakan sistem IntelliCage, uji pengenalan objek baru, dan uji shuttle box untuk menilai validitas model dan kinerja kognitif. Uji pembelajaran IntellCage merupakan sistem dengan hasil tinggi yang mampu menilai navigasi perilaku dasar dan beragam fungsi perilaku dan kognitif kompleks pada hewan pengerat secara bersamaan (Iman et al. 2021). Pengenalan objek baru, yang dikenal karena sifatnya yang relatif rendah stres, berfungsi sebagai uji memori yang efektif untuk tikus, yang cocok untuk mengidentifikasi perubahan neurobehavioral setelah manipulasi farmakologis, biologis, atau genetik (Lueptow 2017). Selain itu, uji shuttle box merupakan alat penilaian perilaku yang paling banyak digunakan untuk mengukur kemampuan belajar dan memori hewan pengerat (Berezhnoy et al. 2020). Memang, konsisten dengan temuan sebelumnya (Wang et al. 2021; Yang et al. 2023), tikus epilepsi kami menunjukkan defisit kognitif dan gangguan yang signifikan dalam pembelajaran dan memori. Dalam penilaian perilaku yang dibandingkan dengan tikus kontrol, tikus epilepsi menunjukkan penurunan fungsi kognitif yang signifikan, bersamaan dengan gangguan yang nyata dalam pembelajaran dan memori. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan BROC secara efektif meningkatkan fungsi kognitif pada tikus epilepsi.
Penelitian telah menunjukkan bahwa epilepsi dapat memicu ekspresi spesies oksigen reaktif (ROS) dan menginduksi OS, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel saraf (Shi et al. 2018). Untuk mengatasi masalah ini, kami berfokus pada BROC, yang mengandung berbagai senyawa bioaktif, termasuk senyawa fenolik, senyawa yang mengandung sulfur, karotenoid, dan tokoferol, yang semuanya menunjukkan aktivitas biologis yang signifikan (Ramirez et al. 2020). Di antara ini, flavonoid dari senyawa fenolik meningkatkan status antioksidan dengan mengatur kadar glutathione, meningkatkan aktivitas enzim antioksidan, dan membersihkan radikal bebas (Kobori et al. 2015; Zhang et al. 2023b). Selain senyawa fenolik, Glukoraphanin dihidrolisis oleh mirosinase untuk membentuk isothiosianat, di antaranya sulforafan (SFN) merupakan komponen aktif utama. SFN melindungi neuron dan mikroglia dengan mengurangi OS dan peradangan melalui aktivasi jalur Nrf2 (Kraft et al. 2004; Ladak et al. 2021). Penelitian telah menunjukkan bahwa SFN dapat meningkatkan disfungsi kognitif dalam berbagai model (Hua et al. 2022; Rajesh dan Ilanthalir 201
5 Kesimpulan dan Keterbatasan
Studi kami menunjukkan bahwa BROC secara signifikan mengurangi gangguan kognitif dan memori pada tikus epilepsi dan meningkatkan kapasitas antioksidan jaringan hipokampus dengan efek neuroprotektif. Temuan ini menunjukkan potensi terapeutik intervensi BROC untuk disfungsi kognitif pascaepilepsi. Meskipun hasil ini menjanjikan, beberapa keterbatasan perlu diperhatikan. Pertama-tama, investigasi kami terbatas pada evaluasi kemanjuran BROC secara keseluruhan tanpa adanya analisis kuantitatif dari komponen bioaktif spesifiknya, yang menghalangi penjelasan komprehensif tentang mekanisme yang mendasarinya. Selain itu, mengingat bahwa disfungsi kognitif setelah epilepsi adalah proses yang bergantung pada waktu, studi kami hanya menyelidiki hasil jangka pendek, yang berpotensi membatasi cakupan temporal kesimpulan kami mengenai perubahan kognitif dan efek kronis. Selain itu, karena penelitian ini masih dalam tahap praklinis, penerapan translasional dari temuan kami memerlukan investigasi lebih lanjut. Di masa mendatang, penelitian harus diarahkan untuk menggambarkan mekanisme molekuler dari konstituen bioaktif BROC dan melakukan studi klinis longitudinal yang komprehensif.
Leave a Reply