ABSTRAK
Resistensi insulin merupakan penyakit metabolik yang umum, dan patogenesisnya masih belum jelas. Penurunan kadar glukagon-like peptide-1 (GLP-1) yang dimediasi oleh perubahan mikrobiota usus mungkin merupakan patogenesisnya. Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efek regulasi dihidromirisetin (DHM) pada kadar GLP-1 dan resistensi insulin yang disebabkan oleh diet tinggi lemak (HFD), dan untuk lebih jauh mengeksplorasi kemungkinan mekanisme molekulernya. Tikus diberi makan HFD untuk menetapkan model resistensi insulin guna menentukan apakah DHM memiliki efek perlindungan. DHM dapat meningkatkan resistensi insulin. DHM meningkatkan serum GLP-1 dengan meningkatkan sekresi GLP-1 usus dan menghambat dekomposisi GLP-1, yang dikaitkan dengan perubahan proporsi limfosit intraepitel usus (IEL) dan penurunan ekspresi CD26 dalam IEL dan TCRαβ+ CD8αβ+ IEL pada tikus yang diinduksi HFD. DHM dapat memperbaiki kadar GLP-1 dan resistensi insulin melalui modulasi mikrobiota usus dan metabolitnya, khususnya pengaturan kandungan asam chenodeoxycholic (CDCA), diikuti oleh penghambatan ekspresi reseptor farnesoid X (FXR) dalam sel L usus dan peningkatan ekspresi mRNA gen glukagon (Gcg) dan sekresi GLP-1. Penelitian ini menunjukkan peran jalur “mikrobiota usus-CDCA” dalam peningkatan kadar GLP-1 usus pada tikus yang diinduksi HFD melalui pemberian DHM, yang menyediakan target baru untuk pencegahan resistensi insulin.
1 Pendahuluan
Resistensi insulin didefinisikan sebagai ketidakmampuan insulin untuk secara optimal merangsang pengangkutan glukosa ke sel-sel tubuh (hiperinsulinemia atau gangguan toleransi glukosa) [1]. Selama beberapa dekade terakhir, telah menjadi jelas bahwa resistensi insulin merupakan faktor risiko umum untuk banyak penyakit, termasuk diabetes melitus Tipe 2 (T2DM), penyakit kardiovaskular, dan penyakit endokrin [2, 3]. Saat ini tidak ada obat yang secara khusus disetujui untuk pengobatan resistensi insulin, tetapi berbagai penelitian telah menunjukkan kemanjuran obat antidiabetik tertentu dalam meningkatkan resistensi insulin [1], seperti agonis reseptor glukagon-like peptide-1 (GLP-1) (GLP-1RA) [4]. GLP-1 adalah incretin yang disekresikan oleh sel-sel L mukosa usus [5]. Ia memiliki fungsi meningkatkan sekresi insulin yang bergantung pada GLu, menghambat sekresi glukagon, memperlambat pengosongan lambung untuk mengurangi GLu darah, dan mengurangi resistensi insulin [6, 7]. GLP-1 didegradasi dengan cepat oleh CD26/DPP-4 (dipeptidyl peptidase IV) usus setelah produksi [6]. DPP-4/CD26, suatu protease serin yang termasuk dalam famili glikoprotein transmembran Tipe II, diekspresikan pada permukaan sel T, sel B, dan sel myeloid [8]. Penelitian menunjukkan bahwa kadar GLP-1 serum secara signifikan lebih rendah pada pasien dengan resistensi insulin, sehingga mempertahankan kadar GLP-1 sangat penting untuk mencegah atau menunda perkembangan resistensi insulin [5]. Meskipun GLP-1RA telah mencapai beberapa kemanjuran dalam pengobatan resistensi insulin, ada juga beberapa kekurangan, seperti efek samping, kepatuhan yang buruk, dan resistensi obat [9, 10]. Dengan demikian, pendekatan yang ditujukan untuk meningkatkan produksi atau pelepasan GLP-1 endogen dianggap sebagai pendekatan inovatif untuk mengobati resistensi insulin.
Dihidromirisetin (DHM) adalah fitokimia polifenol yang ditemukan pada tanaman seperti Ampelopsis grossedentata [11]. Studi kami sebelumnya menemukan bahwa suplementasi DHM secara teratur dapat secara signifikan meringankan kelainan metabolik glukosa darah puasa, hemoglobin glikosilasi, dan cystatin C pada orang dewasa dengan diabetes tipe 2 [12]. DHM secara khusus mendorong pemeliharaan integritas penghalang mukosa usus melalui pengaturan mikrobiota usus dan asam lemak rantai pendek pada model tikus steatohepatitis nonalkohol (NASH) C57BL/6 yang diinduksi oleh diet tinggi lemak (HFD). Selain itu, DHM secara signifikan membalikkan glukosa darah tinggi yang tidak normal pada tikus yang diinduksi HFD [13]. DHM juga dapat meningkatkan kadar GLP-1 serum dan meningkatkan daya tahan latihan pada tikus latihan aerobik [14], yang menunjukkan bahwa DHM dapat berperan dalam mencegah dan mengobati penyakit kronis dengan mengatur mikrobiota usus atau metabolitnya untuk meningkatkan kadar GLP-1 secara in vivo. Literatur yang dipublikasikan menunjukkan bahwa DHM yang dikombinasikan dengan Lacticaseibacillus rhamnosus 1.0320 memulihkan penghalang usus yang diinduksi oleh paparan alkohol akut dengan meningkatkan kadar asam lemak rantai pendek usus [15]. Namun, mekanisme molekuler yang mendasari yang terlibat dengan peningkatan GLP-1 melalui pemberian DHM masih harus dijelaskan lebih lanjut.
Penelitian terkini menemukan bahwa imunitas regional usus berhubungan erat dengan perkembangan resistensi insulin, obesitas, dan penyakit lainnya. Limfosit intraepitel usus (IEL) adalah populasi sel T unik yang terletak di mukosa usus [16, 17]. Berbagai subtipe dan gangguan fungsionalnya memainkan peran penting dalam terjadinya berbagai penyakit metabolik [18, 19]. Telah dilaporkan bahwa IEL integrin β7+ terlibat dalam perkembangan resistensi insulin melalui pengaturan frekuensi sel L dan kadar GLP-1 [19]. Hasil tersebut menunjukkan bahwa beberapa subset khusus IEL usus dapat memengaruhi tingkat ekspresi GLP-1 yang berasal dari usus dan mengatur metabolisme tubuh. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa DHM meningkatkan proporsi sel ILC3 dan IL-22 yang disekresikan oleh sel ILC3 di lamina propria kolon, dan meningkatkan tingkat ekspresi IL-22, yang menyiratkan peran potensial DHM dalam modulasi imunitas regional usus [20]. Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa DHM dapat meningkatkan kadar GLP-1 dan memperbaiki resistensi insulin pada tikus yang diinduksi HFD melalui modulasi mikrobiota usus dan metabolitnya, yang mungkin terkait dengan modulasi sel L usus dan subkelompok sel IEL tertentu.
2 Bahan dan Metode
2.1 Hewan dan Protokol Eksperimen
Eksperimen pada hewan telah disetujui oleh komite etik Universitas Kedokteran Angkatan Darat (Chongqing, Tiongkok; Persetujuan AMUWEC20211008) dan dilakukan dengan mengikuti pedoman dari pusat hewan laboratorium di Universitas Kedokteran Angkatan Darat. Tikus C57BL/6 (tingkat bebas patogen spesifik [SPF], jantan, berusia 6–8 minggu) dibeli dari Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd. (Hunan, Tiongkok) dan dibiarkan beradaptasi selama 1 minggu. Tikus dipelihara dalam kondisi SPF di fasilitas terkontrol dengan akses bebas ke makanan dan air (suhu 20–22°C, kelembapan 45% ± 5%, siklus terang/gelap 12 jam).
Tikus dibagi secara acak menjadi tiga kelompok dengan pemberian diet berbeda selama 8 minggu: (1) Kelompok kontrol (n = 10): diet chow (10% kkal dari lemak, 70% kkal dari karbohidrat, dan 20% kkal dari protein); (2) Kelompok HFD (n = 10): HFD (45% kkal dari lemak, 35% kkal dari karbohidrat, dan 20% kkal dari protein); (3) Kelompok HFD dengan DHM (MUST, Cina) (n = 10): HFD mengandung 0,6% DHM (setara dengan 300 mg/kg·BB/hari). Berat badan dan asupan makanan diukur seminggu sekali selama percobaan. Rata-rata asupan makanan harian (g/hari/tikus) dihitung. Sampel feses dikumpulkan pada minggu ke-8 untuk 16S rRNA, metabolomik tak bertarget, dan penilaian asam empedu (BA). Tikus dipuasakan semalaman dan kemudian dibius untuk pengambilan darah dan ditambahkan inhibitor enzim DPP-4 (konsentrasi akhir 5 µM). Darah disentrifugasi pada 3000 × g selama 10 menit untuk isolasi serum. Jaringan usus dikumpulkan segera setelah eutanasia, IEL diisolasi dengan flow cytometry.
Untuk percobaan pengobatan antibiotik (Abx), tikus diberi makan HFD yang disuplemen dengan atau tanpa 0,06% DHM selama 8 minggu dan terus-menerus diintervensi dengan air yang mengandung Abx selama 4 minggu dari minggu ke-5 hingga ke-8. Intervensi Abx dilakukan dengan menambahkan campuran Abx (vankomisin hidroklorida 0,5 g/L, neomisin sulfat 1 g/L, metronidazol 1 g/L, dan ampisilin 1 g/L) ke dalam air steril untuk menggantikan air minum harian.
Untuk percobaan transplantasi mikrobiota usus, tikus diberikan HFD dengan atau tanpa 0,06% DHM selama 8 minggu dan diberi makan Abxs untuk menghilangkan mikrobiota usus pada minggu ke-5 dan ke-6. Dari minggu ke-7 hingga ke-8, supernatan sampel feses yang diencerkan dari donor tikus HFD atau HFD + DHM ditransplantasikan melalui gavage lambung. Secara rinci, sampel feses segar tikus dalam kelompok HFD atau kelompok HFD + DHM dikumpulkan dengan tabung EP 1,5 mL steril pada akhir minggu ke-8, dan disimpan dalam lemari es pada suhu -80°C untuk digunakan nanti (200 mg per hewan per waktu). Selama transplantasi mikrobiota usus, 200 mg/sampel feses tikus diencerkan dengan 2 mL larutan natrium klorida steril (0,9%), dan resuspensi feses diperoleh dengan pengocokan selama 5 menit. Setelah sentrifugasi, presipitat dan supernatan diperoleh, dan supernatan disimpan untuk perfusi lambung. Pada saat pemberian intragastrik, berat badan tikus ditimbang, dan pemberian intragastrik dilakukan sesuai dengan berat badan tikus, dan jumlah pemberian intragastrik sekitar 10 µL/g. Tikus diberi cairan gavage setiap hari selama minggu ke-7–8.
2.2 Analisis Biokimia
Glukosa serum, triasilgliserol (TG), kolesterol lipoprotein densitas rendah (LDL-C), kolesterol lipoprotein densitas tinggi (HDL-C), dan kolesterol (CHO) diukur menggunakan penganalisis biokimia otomatis. GLP-1 serum diukur menggunakan kit biokimia komersial (Jingmei, Tiongkok).
2.3 Uji Toleransi Glukosa Oral (OGTT) dan Uji Toleransi Glukosa Intraperitoneal (IPGTT)
Setelah berpuasa semalaman, kadar glukosa darah basal diukur terlebih dahulu, dan tikus diberi glukosa oral atau glukosa intraperitoneal (2 g/kg), dan kadar glukosa darah diukur dengan meteran glukosa darah pada menit ke-0, 15, 30, 60, 90, dan 120. Gangguan toleransi glukosa dinilai berdasarkan area di bawah kurva (AUC).
2.4 Uji Resistensi Insulin (ITT)
Selama uji toleransi insulin (ITT), tikus disuntik insulin secara intraperitoneal (0,75 U/kg) setelah berpuasa selama 6 jam, dan kadar glukosa darah diukur dengan meteran glukosa darah pada menit ke-15, 30, 60, 90, dan 120. Resistensi insulin dinilai berdasarkan AUC.
2.5 Pewarnaan Imunofluoresensi
Untuk pewarnaan imunofluoresensi jaringan usus (n = 3 per kelompok), jaringan usus segar ditanamkan dalam senyawa suhu pemotongan optimal (OCT) dan dipotong menjadi beberapa bagian usus beku. Kaca objek diperlakukan dengan antibodi GLP-1 dan kemudian dipaparkan dengan Alexa Fluor 488 goat Antirabbit IgG dan Alexa Fluor 594 goat antirabbit IgG. Inti diwarnai dengan 4,6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI). Setelah dicuci dengan phosphate buffered saline (PBS), kaca objek dipasang menggunakan Prolong Gold Antifade Mountant (Life Technologies) dan difoto dengan kamera mikroskop fluoresensi.
2.6 Ekstraksi DNA, 16S rRNA, dan Illumina MiSeq Sequencing
DNA genom mikroba diekstraksi dari setiap sampel tinja menggunakan E.Z.N.A. Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, AS). DNA yang diekstraksi dideteksi pada gel 1% agarosa (biowest, ES), dan konsentrasi serta kemurnian DNA ditentukan menggunakan spektrofotometer ultra-mikro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, AS). Wilayah hipervariabel V3–V4 dari gen 16S rRNA bakteri diperkuat menggunakan pasangan primer. Sistem reaksi PCR 20 µL mencakup 1 µL (10 ng) DNA cetakan, masing-masing 0,8 µL (5 µM) primer maju dan mundur, 0,4 µL FastPfu DNA Polimerase, 4 µL 5 × FastPfu Buffer, dan 2 µL (2,5 mM) dNTP. Kondisi reaksi PCR tercantum sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95°C selama 30 menit, diikuti oleh 30 siklus denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72°C selama 45 detik, dan ekstensi stabil pada suhu 72°C selama 10 menit hingga akhir reaksi. Produk PCR diperiksa dengan elektroforesis gel pada gel agarosa 2%, dan kemudian produk PCR dimurnikan menggunakan AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Axygen, AS) sesuai dengan petunjuk pabrik. Produk PCR diukur menggunakan Quantus Fluorometer (Promega, AS). Menurut persyaratan sekuensing setiap sampel, proporsi pencampuran yang sesuai dilakukan. Gunakan NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit untuk membangun basis data. Platform NovaSeq PE250 dari Illumina digunakan untuk sekuensing. Urutannya adalah unit taksonomi operasional (OTU) yang dikelompokkan menurut 97% kesamaan menggunakan perangkat lunak UPARSE (http://drive5.com/uparse/). Semua analisis data dilakukan pada Meiji Biological Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com).
2.7 Analisis Metabolomik Tak Tertarget
Sampel feses sebanyak 50 mg ditempatkan dalam tabung sentrifus 2 mL dengan manik tanah berdiameter 6 mm. Metabolit diekstraksi dengan 400 µL ekstrak (metanol:air = 4:1 V/V) yang mengandung 0,02 mg/mL standar internal (L-2-klorofenilalanina). Larutan sampel digerus selama 6 menit (−10°C, 50 Hz) dalam triturator krio-jaringan, lalu diekstraksi dengan ultrasonik suhu rendah selama 30 menit (5°C, 40 kHz). Sampel disimpan pada suhu -20°C selama 30 menit, disentrifugasi selama 15 menit (4°C, 13.000 × g), dan supernatan dipindahkan ke botol sampel dengan kanula bagian dalam untuk analisis. Sampel kontrol kualitas (QC) disiapkan dengan mencampur metabolit semua sampel dalam volume yang sama. Selama analisis instrumental, satu sampel QC dimasukkan ke setiap empat sampel untuk memeriksa pengulangan seluruh proses analisis. Platform instrumen analisis LC-MS ini adalah sistem UHPLC-Q Exactive HF-X dari Thermo Flying Company. Setelah operasi, data mentah LC-MS diimpor ke perangkat lunak pemrosesan metabonomik Progenesis QI (Waters Corporation, Milford, AS) untuk penyaringan dasar, identifikasi puncak, integrasi, koreksi waktu retensi, dan penyelarasan puncak. Akhirnya, matriks data waktu retensi, rasio massa terhadap muatan, dan intensitas puncak diperoleh. Pada saat yang sama, spektrum massa MS dan MSMS dicocokkan dengan basis data metabolik publik HMDB (http://www.hmdb.ca/) dan Metlin (https://metlin.scripps.edu/), serta basis data yang dibangun sendiri oleh Meiji untuk memperoleh informasi metabolit. Setelah menelusuri basis data, data matriks diunggah ke Meiji Biological Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com) untuk analisis data. Untuk menyaring metabolit diferensial di antara tiga kelompok yang ditunjukkan, kami menetapkan ambang batas VIP > 1,0, FC > 1,0, atau <1, p < 0,05. Anotasi jalur metabolik metabolit diferensial dilakukan melalui basis data KEGG (https://ww.kegg.jp/kegg/pathway.html), dan jalur yang terlibat dalam metabolit diferensial diperoleh. Analisis pengayaan jalur dilakukan oleh paket Python scipy.stats, dan jalur biologis yang paling relevan dengan perawatan eksperimental diperoleh dengan uji eksak Fisher. 2.8 Analisis Metabolomik Target Asam Empedu (BA)
Pipet 100 µL sampel dengan tepat, tambahkan 50 µL larutan kerja standar internal (200 ng/mL), lalu tambahkan 350 µL larutan ekstraksi (metanol), aduk dan campur selama 30 detik, lakukan ultrasonografi suhu rendah selama 30 menit (5°C, 40 kHz), diamkan selama 30 menit pada suhu −20°C, dan sentrifus selama 15 menit pada suhu 4°C, 13.000 × g.
2.8 Bile Acids (BAs) Targeted Metabolomics Analysis
Precisely pipette 100 µL of sample, add 50 µL of internal standard working solution (200 ng/mL), then add 350 µL of extraction solution (methanol), vortex and mix for 30 s, perform low temperature ultrasound for 30 min (5°C, 40 kHz), stand for 30 min at −20°C, and centrifuge for 15 min at 4°C, 13 000 × g. The supernatant was dried with nitrogen, redissolved with 100 µL of 50% acetonitrile water, vortexed and mixed for 30 s, ultrasonically treated at low temperature for 10 min (5°C, 40 kHz), centrifuged at 4°C for 15 min with 13 000 × g, and the supernatant was detected by LC-MS/MS. The samples were analyzed by LC-MS/MS using an Exion LC AD liquid phase system in combination with a QTRAP 6500+ mass spectrometer (Shanghai Meiji Biomedical Technology Co., Ltd.).
After the operation, the original data of LC-MS was imported into Sciex quantitative software OS for automatic identification and integration of each ion fragment with default parameters, and manual inspection was assisted to draw a linear regression standard curve with the ratio of the peak area of the analyte to the peak area of the internal standard as the ordinate and the concentration of the analyte as the abscissa. Sample concentration calculation: substitute the ratio of peak area of sample analyte to peak area of internal standard into the linear equation to calculate the concentration result.
2.9 IELs Isolation and Flow Cytometry
After mice were sacrificed, the small intestinal tissues in each group were quickly separated, and the mesentery and adipose tissues were removed in ice-cold PBS. The intestinal tissues were cut open along the longitudinal axis, and the contents were removed and washed twice in ice-cold PBS. Small intestinal tissue was cut into small pieces and put into 50 mL EP tubes, each tube was added with 20 mL of digestive juice (5% FBS + D-Hanks + 1 mM DTT + 5 mM EDTA + 10 mM HEPES), and then shaken for 20 min on a constant temperature shaker at 37°C and 210 × g. After shaking, swirl the EP tube containing the digestion solution for 20 s, filter and collect the digestion solution into a new 50 mL EP tube using a 70 µm strainer, and add 20 mL to the tube, repeat the above steps, and collect the filtrate. The pooled digest was centrifuged at 2000 × g for 5 min, and the supernatant was discarded. The pellet was resuspended in 9 mL of 40% Percoll and transferred to a 15 mL round-bottomed EP tube. Add 5 mL of 70% Percoll to the bottom of each EP tube through a pipette, centrifuge at 900 × g at 20°C, horizontal density gradient for 20 min, and adjust the acceleration and deceleration of the centrifuge to 0. After centrifugation, the round-bottomed EP tube was carefully collected to the pipette rack. The liquid was divided into three layers, and the middle white layer was the IELs cells. Use a Buss pipette to suck 4 mL of the intermediate tunica albuginea into a 15 mL EP tube with a sharp bottom, and add 8 mL of washing solution (PBS + 5%FBS) for washing, then centrifuge at 2000 × g for 5 min, and collect the precipitate as IELs. The gating strategy of FACS is shown in Supporting Information Data S5.
2.10 Cell Culture and Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
The mouse colon cell line STC-1 (RRID: CVCL_J405) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). The cells were cultured in DEME growth medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37°C and 5% CO2. Cells were plated into a 24-well plate with an appropriate density and then exposed to vehicle (DMSO, the control, less than 0.1%) with or without 80 µM of chenodeoxycholic acid (CDCA). After incubation, the culture supernatants were collected and the secreted GLP-1 was detected according to the manufacturers’ instructions by ELISA assay.
2.11 RNA Isolation and Quantitative Reverse Transcription PCR
Total RNA was isolated using 1 mL Trizol (Invitrogen). The cDNA templates were obtained from 500 ng of purified RNA using iScript Reverse Transcription Supermix for real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR, Bio-Rad, CA). 1×SYBR Green Master Mix buffer (Takara, Otsu, Japan) was used for quantitative RT-PCR, and assays were performed on a Roche lightCycler 480 II PCR machine. Gene specific primers are listed in Table 1. The targeted gene levels were normalized to β-actin housekeeping gene levels, and the results were analyzed using the 2−ΔΔCt method.
2.12 Analisis Statistik
Hasil disajikan sebagai mean ± SD. Signifikansi statistik antara dua kelompok berbeda dianalisis menggunakan uji t Student yang tidak berpasangan dan ANOVA satu arah serta uji Kruskal–Wallis H digunakan di antara tiga kelompok. Analisis statistik dihitung menggunakan perangkat lunak SPSS 19.0. Korelasi antara BA dan kelimpahan mikrobioma dilakukan menggunakan analisis korelasi Spearman. Perbedaan antara kelompok eksperimen dianggap signifikan pada p < 0,05.
3 Hasil
3.1 DHM Meningkatkan Resistensi Insulin dengan Peningkatan Efek Incretin pada Tikus yang Diinduksi HFD
Tikus diberikan HFD dengan atau tanpa DHM selama 8 minggu. Tidak ada perbedaan signifikan dalam asupan makanan di antara kelompok yang berbeda (Data Informasi Pendukung S1A dan B). Berat badan diukur setiap minggu (Gambar 1A), dan pemberian HFD menyebabkan peningkatan berat badan yang signifikan pada minggu ke-8, yang diperbaiki dengan intervensi DHM (Gambar 1B). Untuk menyelidiki lebih lanjut efek DHM pada homeostasis glukosa dan sensitivitas insulin, uji OGTT dan ITT dilakukan. Hasil OGTT menunjukkan bahwa DHM secara signifikan dapat meringankan kelainan toleransi glukosa yang disebabkan oleh HFD (Gambar 1C, D). Uji ITT menunjukkan bahwa HFD meningkatkan resistensi insulin dibandingkan dengan kelompok Kontrol, sementara perubahan tersebut dikurangi dengan pengobatan DHM (Gambar 1E, F). Untuk menyelidiki dampak potensial DHM pada efek incretin, kami melakukan eksperimen IPGTT dan OGTT. Dikombinasikan dengan hasil IPGTT dan OGTT, ditunjukkan bahwa HFD dapat mengganggu efek incretin tikus, yang sebagian besar dipulihkan oleh pemberian DHM, seperti yang ditunjukkan oleh nilai ∆AUC yang lebih tinggi pada kelompok HFD + DHM; nilai ini menunjukkan perbedaan area antara kurva IPGTT dan OGTT (Gambar 1G–J). Sementara itu, kadar glukosa darah puasa meningkat secara signifikan pada kelompok HFD, yang secara signifikan dihambat oleh pengobatan DHM (Gambar 1K). Dalam hal perubahan metabolisme lipid serum, hasil menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok Kontrol, kadar serum CHO (Gambar 1L), LDL-C (Gambar 1M), dan TG (Gambar 1N) pada kelompok HFD meningkat secara signifikan, sedangkan kadar HDL-C (Gambar 1O) menurun secara signifikan (p < 0,05). Namun, perubahan kadar CHO, LDL-C, TC, dan HDL-C pada kelompok HFD secara efektif dikurangi oleh pengobatan DHM, masing-masing (Gambar 1L–O). Hasil ini menunjukkan bahwa DHM secara efektif dapat memperbaiki resistensi insulin yang diinduksi HFD serta metabolisme glukosa dan lipid yang abnormal, yang mungkin terkait dengan perbaikan efek incretin.
3.2 DHM Meningkatkan Kadar GLP-1 Serum dengan Meningkatkan Sekresi GLP-1 di Usus dan Menghambat Dekomposisi GLP-1 pada Tikus yang Diinduksi HFD
Kami menggunakan uji imunofluoresensi untuk menyelidiki ekspresi protein GLP-1 di usus halus tikus (Gambar 2A). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi GLP-1 menurun secara signifikan pada kelompok HFD dibandingkan dengan kelompok Kontrol, sedangkan ekspresi GLP-1 meningkat setelah pengobatan DHM (Gambar 2B). Sementara itu, DHM meningkatkan kadar GLP-1 serum (Gambar 2C) dan ekspresi relatif mRNA gen glukagon (Gcg) di jaringan usus (Gambar 2D). Secara kolektif, hasil penelitian menunjukkan DHM meningkatkan sekresi GLP-1 usus dan kadar GLP-1 serum pada tikus yang diinduksi HFD..
3.3 DHM Memperbaiki Kadar GLP-1 dan Resistensi Insulin melalui Modulasi Mikrobiota Usus pada Tikus yang Diinduksi HFD
Untuk memverifikasi peran mikrobiota usus dalam pengaturan resistensi insulin sistemik oleh DHM, kami masing-masing melakukan percobaan pengobatan Abx dan transplantasi mikrobiota usus. Hasil percobaan pengobatan Abx menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan dalam asupan makanan antara kelompok HFD + Abx dan HFD + DHM + Abx selama percobaan pengobatan Abx (Gambar 3A). Sementara itu, kami mengukur glukosa darah puasa pada akhir minggu ke-4 dan melakukan percobaan OGTT. Hasil penelitian menunjukkan toleransi glukosa yang terganggu pada kelompok HFD + DHM + Abx berkurang secara signifikan dan glukosa darah puasa menurun secara signifikan, jika dibandingkan dengan kelompok HFD + Abx sebelum pengobatan Abx (Gambar 3B–D). Campuran Abx ditambahkan ke air minum tikus selama 4 minggu untuk pengobatan Abx. Menariknya, pada akhir minggu ke-8, efek DHM pada glukosa darah puasa dan toleransi glukosa menghilang (Gambar 3E–G). Analisis IPGTT yang dikombinasikan dengan OGTT menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan antara kedua kelompok dalam efek incretin setelah pengobatan Abx (Gambar 3H–J). Hasil uji imunofluoresensi menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan pada tingkat sekresi GLP-1. Kemudian kami memeriksa tingkat ekspresi mRNA Gcg intestinal dan kandungan GLP-1 serum antara kelompok HFD + Abx dan HFD + DHM + Abx setelah pengobatan Abx. Hasil penelitian menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan antara kedua kelompok. Secara keseluruhan, mikrobiota usus memainkan peran kunci dalam peningkatan resistensi insulin sistemik oleh DHM (Gambar 3K–N).
3.4 DHM Mengubah Komposisi Mikrobiota Usus yang Terkait dengan Resistensi Insulin pada Tikus yang Diinduksi HFD
Untuk menyelidiki bagaimana DHM memodulasi mikrobiota usus untuk meningkatkan sekresi GLP-1 sel L usus, kami mengevaluasi biospektrum mikrobiota usus dengan sequencing 16S rRNA dan analisis bioinformatika. Hasilnya menunjukkan indeks Ace, Chao, Sobs, dan Shannon dari kelompok HFD berbeda secara signifikan dengan kelompok Kontrol (p < 0,05). Meskipun indeks Sobs berbeda antara kelompok HFD dan HFD + DHM, tidak ada perbedaan yang signifikan di antara ketiga indeks lainnya (Gambar 5A). Sementara itu, uji PCoA pada hasil kadar OTU menunjukkan distribusi keragaman mikrobiota usus pada kelompok HFD berbeda secara signifikan dari kedua kelompok lainnya (Gambar 5B). Secara kolektif, keragaman mikrobiota usus tikus dalam kelompok HFD mungkin berubah secara signifikan.
3.5 DHM Dapat Memodulasi Jalur Metabolisme Mikrobiota Usus pada Tikus yang Diinduksi HFD
Untuk memverifikasi efek DHM pada metabolit usus dalam kelompok HFD, kami mengumpulkan feses dari setiap kelompok pada minggu ke-8, dan melakukan analisis metabolomik nontarget dengan LC/MC. Hasil PLS-DA menunjukkan bahwa metabolit dari setiap kelompok terpisah dengan baik dari kelompok HFD, dan hasil uji permutasi menunjukkan kemampuan prediksi model PLS-DA baik dan tidak ada fenomena over-fitting (Gambar 6A–D).
3.6 DHM Mengatur Metabolisme Asam Empedu Usus dan Menghambat Ekspresi CDCA dan FXR pada Tikus yang Diinduksi HFD
Asam empedu memiliki beberapa fungsi dalam mengatur metabolisme usus [23]. Untuk mengeksplorasi peran metabolisme asam empedu dalam peningkatan resistensi insulin oleh DHM, kami mengumpulkan feses dan melakukan analisis terarah terhadap metabolisme asam empedu. Hasil analisis PLS-DA menunjukkan komponen utama asam empedu pada kelompok HFD terpisah secara signifikan dari tiga kelompok lainnya, dan komponen utama HFD + DHM tumpang tindih secara signifikan dengan komponen utama kelompok Kontrol (Gambar 7A). Hasil tersebut menunjukkan bahwa metabolisme asam empedu pada tikus HFD diatur secara tidak normal, dan DHM dapat secara signifikan mengurangi perubahan tersebut, yang mungkin konsisten dengan kelompok Kontrol. Untuk menganalisis perubahan asam empedu usus, kami selanjutnya mendeteksi komposisi asam empedu usus. Asam empedu terkonjugasi dan tak terkonjugasi dihitung (Gambar 7B, C). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar total asam empedu pada kelompok HFD secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok Kontrol (Gambar 7E). Dibandingkan dengan kelompok Kontrol, kadar asam empedu terkonjugasi dan asam empedu tak terkonjugasi meningkat secara signifikan pada kelompok HFD dan menurun setelah intervensi DHM (Gambar 7D). Namun, hasil penelitian menunjukkan tidak ada perubahan signifikan pada rasio asam empedu terkonjugasi/tak terkonjugasi antara kelompok HFD dan Kontrol. DHM secara signifikan mengurangi rasio asam empedu terkonjugasi/tak terkonjugasi antara kelompok HFD + DHM dan HFD (Gambar 7F). Hasil ini menunjukkan bahwa DHM dapat secara signifikan mengubah metabolisme asam empedu usus pada kelompok HFD.
3.7 CDCA Menghambat Sekresi GLP-1 dengan Merangsang dan Meningkatkan Ekspresi FXR dalam Sel L Usus
Untuk lebih lanjut memverifikasi efek CDCA pada sekresi GLP-1 oleh sel L usus, kami selanjutnya menggunakan sel STC-1 untuk menyelidiki bagaimana CDCA menghambat sekresi GLP-1. Sel STC-1 dirangsang dengan berbagai konsentrasi DHM (1, 5, 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 µM) selama 24 jam, dan kemudian kami menilai viabilitas sel dengan uji kit penghitungan sel-8 (CCK-8) dan mengukur kadar GLP-1 dalam supernatan kultur yang dipanen pada 0, 10, 40, dan 80 µM. Hasil kami menunjukkan bahwa CDCA tidak memiliki efek signifikan pada proliferasi sel STC-1 selama rentang 1 hingga 80 µM. Pada 100 µM, viabilitas sel STC-1 dihambat secara signifikan (Gambar 8A). Namun, dibandingkan dengan kelompok Kontrol, 80 µM CDCA secara signifikan menghambat sekresi GLP-1 sel STC-1 (Gambar 8B–D). Sel STC-1 selanjutnya diobati dengan 80 µM CDCA tanpa antagonis FXR Z-guggulsterone (Z-Gug) (10 µM) selama 24 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa CDCA mengakibatkan peningkatan ekspresi mRNA FXR, penurunan ekspresi mRNA Gcg, dan sekresi GLP-1, masing-masing. Dengan adanya Z-Gug, ekspresi mRNA FXR menurun secara signifikan, dan ekspresi mRNA Gcg serta sekresi GLP-1 meningkat, masing-masing (Gambar 8E–H). Singkatnya, CDCA meningkatkan ekspresi mRNA relatif FXR dan menghambat ekspresi mRNA relatif Gcg dan ekspresi GLP-1 dalam sel L usus.
4 Pembahasan
Resistensi insulin telah dianggap sebagai faktor risiko umum untuk berbagai penyakit metabolik, yang dapat menyebabkan terjadinya dan berkembangnya berbagai penyakit metabolik [24]. Patogenesis resistensi insulin bersifat kompleks. Mikrobiota usus [25, 26] dan gangguan metabolit, asupan energi yang berlebihan, dan imunitas usus [27] memainkan peran penting dalam patogenesis resistensi insulin. Saat ini, belum ada pengobatan baru yang efektif untuk resistensi insulin [28]. DHM sebagian besar diekstrak dari tanaman merambat berkayu dari genus Ampelopsis dari famili Vitaceae dan juga diekstrak dari Hovenia dulcis Thunb. [29]. DHM memiliki peran potensial dalam pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit metabolik kronis [30]. Sejumlah besar percobaan telah membuktikan bahwa DHM dapat mengurangi aterosklerosis dan meningkatkan glukosa darah dan lipid darah [31, 32]. GLP-1 disekresikan oleh sel L usus, yang dapat mengatur glukosa darah dan resistensi insulin. GLP-1 dipecah dengan cepat oleh DPP-4/CD26 [6], yang sebagian besar diekspresikan pada permukaan IEL. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa DHM dapat meningkatkan sintesis dan sekresi GLP-1 dalam sel L usus melalui jalur “gut microbiota-CDCA”; sementara itu, dapat mengatur proporsi TCRαβ+ CD8αβ+ IEL dan ekspresi CD26, mengurangi degradasi GLP-1, sehingga meningkatkan kadar GLP-1 serum dan mengurangi resistensi insulin.
Pertama, kami membuat model resistensi insulin yang diinduksi HFD. Kemudian, kami menyelidiki efek DHM pada metabolisme glukosa dan resistensi insulin. Hasilnya menunjukkan bahwa DHM dapat secara signifikan mengurangi glukosa serum, dan secara signifikan meringankan resistensi insulin dan gangguan toleransi glukosa, yang merupakan indeks inti untuk mengevaluasi diabetes. Selain itu, DHM juga memengaruhi metabolisme lipid tikus HFD. DHM secara efektif dapat meringankan perubahan TG, CHO, LDL, dan HDL dalam kelompok HFD. Efek incretin menggambarkan fenomena bahwa glukosa oral menyebabkan sekresi insulin yang lebih tinggi daripada glukosa intraperitoneal. Efek incretin mengacu pada efek glukosa oral yang menghasilkan sekresi insulin yang lebih tinggi daripada glukosa intraperitoneal. Untuk menentukan peran potensial dalam efek DHM pada efek incretin, kami melakukan eksperimen IPGTT dan OGTT. Data menunjukkan bahwa efek incretin tikus HFD secara signifikan lebih lemah daripada tikus Kontrol; DHM dapat meningkatkan efek incretin tikus yang diobati dengan HFD secara signifikan. Dengan mendeteksi kadar GLP-1 dalam serum, kami menemukan bahwa kadar GLP-1 serum dalam kelompok HFD menurun secara signifikan, dan meningkat setelah intervensi DHM. Hasil imunofluoresensi menunjukkan ekspresi GLP-1 dalam jaringan usus tikus HFD meningkat secara signifikan setelah pengobatan DHM. Ekspresi mRNA Gcg konsisten dengan hasil imunofluoresensi. Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa efek menguntungkan DHM pada metabolisme glukosa dan resistensi insulin sebagian dicapai melalui peningkatan kadar GLP-1.
DPP-4/CD26, protease serin yang termasuk dalam famili glikoprotein transmembran Tipe II, diekspresikan pada permukaan sel T, sel NK, dan sel B [33]. Ia memiliki aktivitas enzimatik dan secara selektif dapat membersihkan dipeptida N-terminal dari polipeptida dan protein yang mengandung prolin atau alanin pada posisi kedua. GLP-1 yang disekresikan oleh sel L usus dengan cepat didegradasi oleh CD26/DPP-4, sehingga membatasi fungsi biologisnya [34]. IEL adalah populasi sel T unik yang terletak di mukosa usus, yang berhubungan erat dan berinteraksi dengan sel epitel usus (IEC). Telah ditemukan bahwa IEL integrin β7+ terlibat dalam pengembangan resistensi insulin. Sel L usus pada tikus β7−/− meningkat secara signifikan, kadar GLP-1 meningkat, dan toleransi glukosa meningkat secara signifikan. Ketika tikus β7−/− diberi makan dengan diet tinggi lemak dan tinggi gula, mereka memiliki resistensi yang signifikan terhadap obesitas, diabetes, dan sebagainya [19]. Studi ini menunjukkan bahwa beberapa subset khusus IEL usus dapat memengaruhi tingkat ekspresi GLP-1 yang berasal dari usus dan mengatur metabolisme tubuh, sehingga intervensi yang menargetkan IEL dapat menjadi strategi baru untuk mengatur kadar GLP-1. Untuk memverifikasi apakah IEL terlibat dalam regulasi pemeliharaan konsentrasi fisiologis GLP-1, kami memisahkan IEL dan mendeteksinya dengan flow cytometry. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perubahan signifikan dalam jumlah IEL di antara kelompok, tetapi ekspresi CD26 pada kelompok HFD meningkat dan menurun setelah intervensi DHM. Ekspresi CD26 menurun setelah intervensi DHM. IEL TCRαβ+CD8αβ+ meningkat secara signifikan pada HFD, tetapi proporsinya menurun setelah intervensi DHM. CD26 yang diekspresikan oleh IEL TCRαβ+CD8αβ+ meningkat pada kelompok HFD tetapi menurun setelah intervensi DHM. Secara keseluruhan, disarankan bahwa IEL TCRαβ+CD8αβ+ terlibat dalam regulasi degradasi GLP-1.
Telah dilaporkan dalam banyak penelitian bahwa mikrobiota usus berperan penting dalam pengaturan metabolisme tubuh [35, 36]. Akan tetapi, apakah mikrobiota usus berperan penting dalam pengaturan sekresi GLP-1 usus oleh DHM tidak diketahui. Untuk memverifikasi apakah mikrobiota usus berperan penting dalam sekresi GLP-1, kami melakukan percobaan pengobatan dan transplantasi Abx. Hasil percobaan sama seperti yang diharapkan. Terdapat intoleransi glukosa dan resistensi insulin yang signifikan antara kelompok HFD + DHM + Abx dan kelompok HFD + Abx sebelum eliminasi mikrobiota usus. Setelah eliminasi mikrobiota usus, perbedaan resistensi insulin antara kedua kelompok terhambat, dan sekresi GLP-1 tidak mengalami perubahan yang berbeda. Dalam percobaan transplantasi mikrobiota usus, penghambatan sekresi GLP-1, resistensi insulin, dan gangguan toleransi glukosa diamati berkurang setelah transplantasi mikrobiota usus. Hasil kami menunjukkan efek menguntungkan DHM pada homeostasis glukosa dan resistensi insulin dikaitkan dengan mikrobiota usus. Mikrobiota usus, sebagai mikroorganisme parasit penting di usus inang, berpartisipasi penuh dalam metabolisme nutrisi inang dan terutama dipengaruhi oleh pola makan [35, 37]. Obesitas yang disebabkan oleh HFD telah terbukti berhubungan dengan disregulasi mikrobiota usus, seperti yang ditunjukkan oleh penurunan keragaman mikrobiota usus dan perubahan komposisi mikrobioma usus [38, 39]. Oleh karena itu, kami mengukur mikrobiota usus untuk mempelajari lebih lanjut mekanisme pengaturannya. Hasil analisis 16S rRNA menunjukkan bahwa keragaman dan kelimpahan mikrobiota usus dalam kelompok HFD berubah secara signifikan. DHM dapat memodulasi keragaman mikrobiota usus, terutama penurunan Desulfovvibrionaceae, yang memperlihatkan fitur protektif. DHM secara efektif dapat mengatur perubahan kelimpahan norank_f_Desulfovibrionaceae dan Lactobacillus yang disebabkan oleh HFD pada tingkat genus. Pengaturan mikroorganisme utama ini oleh DHM terkait erat dengan efek terapeutiknya pada resistensi insulin, yang dikonfirmasi oleh analisis korelasi. Bukti yang terkumpul mendukung peran penting komposisi mikrobiota usus dalam memengaruhi metabolisme inang dan menunjukkan bahwa penargetan komposisi mikrobiota usus dapat mengatur metabolisme inang dan membalikkan resistensi insulin [40]. Efek mikrobiota usus pada metabolisme energi inang terutama melalui asam amino, vitamin, asam lemak rantai pendek [41, 42], asam empedu [36], dan metabolit lain, yang telah berubah dalam berbagai tingkat pada obesitas. Profil metabolit tikus yang diinduksi HFD dan tikus yang diobati dengan DHM dianalisis dengan metabonomik nontarget. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa HFD jangka panjang mengganggu proses fisiologis dan biokimia pada tikus dengan memengaruhi kelompok jalur metabolisme yang relevan. Pola metabolit pada tikus yang diinduksi HFD secara signifikan berbeda dari yang ada pada tikus sehat, tergantung pada perubahan metabolisme gliserofosfolipid, metabolisme kolin, dan infeksi virus herpes terkait sarkoma Kaposi. Sementara itu, fagositosis yang dimediasi Fc gamma R, jalur pensinyalan PLD, metabolisme tirosin, pencernaan dan penyerapan karbohidrat, dan metabolisme asam empedu juga terkait erat dengan intervensi DHM pada obesitas yang diinduksi HFD (Tabel 2).
Reseptor Fcγ adalah kelas reseptor permukaan sel yang dapat mengikat ujung Fc antibodi dan menghasilkan sinyal intraseluler terutama melalui urutan aktivasi ITAM mereka. Reseptor Fcγ terlibat dalam banyak fungsi sistem imun, seperti fagositosis, pelepasan mediator inflamasi, dan sitotoksisitas seluler yang bergantung pada antibodi. Ini adalah komponen penting dari respons imun bawaan dan memainkan peran kunci dalam mekanisme pertahanan inang dalam penyerapan dan penghancuran patogen infeksius. Pensinyalan PLD merupakan komponen penting dari respons imun bawaan. Jalur PLD merupakan sistem transduksi sinyal sekunder penting lainnya dalam sel. Ini memiliki fungsi biologis penting, termasuk berpartisipasi dalam diferensiasi sel, proliferasi dan motilitas, dan meningkatkan respons stres melalui retikulum endoplasma. Jalur metabolisme tirosin menggambarkan berbagai cara tirosin dikatabolisme atau diubah untuk menghasilkan berbagai molekul penting secara biologis. Tirosin memainkan peran kunci dalam sintesis hormon tiroid. Hormon tiroid diproduksi dan dilepaskan oleh kelenjar tiroid dan meliputi triiodotironin (T3) dan tiroksin (T4). Dalam penelitian ini, hasil analisis 16S rRNA menunjukkan bahwa kelimpahan Lactobacillus di saluran usus menurun setelah intervensi DHM. Sementara itu, kami berkonsultasi dengan sejumlah besar penelitian dan menemukan bahwa Lactobacillus adalah sumber utama BSH. Oleh karena itu, kami menemukan bahwa kandungan BSH berkurang, setelah intervensi DHM. Secara keseluruhan, hasil tersebut menunjukkan bahwa DHM dapat memengaruhi metabolisme asam empedu pada tikus yang diinduksi oleh HFD melalui mikrobiota usus.
Sel STC-1 merupakan lini sel L intestinal yang umum digunakan secara in vitro [47]. Pada sel STC-1, kami menemukan bahwa CDCA dapat meningkatkan ekspresi FXR. FXR merupakan reseptor utama yang terlibat dalam sekresi GLP-1, yang dapat menghambat transkripsi mRNA Gcg dan mengurangi sekresi GLP-1. Oleh karena itu, kami mendeteksi mRNA Gcg, dan hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi mRNA Gcg menurun. Sementara itu, kami memperlakukan sel STC-1 dengan CDCA dan inhibitor reseptor FXR Z-Gug, masing-masing. Hasilnya menunjukkan bahwa setelah reseptor FXR dihambat, kadar mRNA Gcg dan GLP-1 menurun secara signifikan. Hasilnya menunjukkan bahwa CDCA menghambat ekspresi Gcg dan mengurangi sekresi GLP-1 dengan mengaktifkan FXR.
Penelitian ini memiliki beberapa keterbatasan. Pertama-tama, kami belum melakukan eksperimen transplantasi dengan mikrobiota usus spesifik pada tikus untuk memverifikasi peran mikrobiota usus diferensial dalam resistensi insulin. Kedua, CDCA intestinal ditemukan berubah pada kelompok HFD, tetapi belum ada percobaan suplementasi hewan yang relevan. Perlu dilakukan peningkatan penelitian lebih lanjut untuk menafsirkan hipotesis ilmiah secara menyeluruh.
Leave a Reply