Ringkasan
Rumput laut hijau Ulva compressa merupakan model yang menjanjikan untuk biologi fungsional. Selain penelitian historis tentang pertumbuhan dan perkembangan, data -omik dan perangkat molekuler untuk transformasi stabil juga tersedia. Namun, perangkat yang lebih efisien diperlukan untuk mempelajari fungsi gen.
Di sini, kami memperluas perangkat molekuler untuk Ulva.
Kami menyaring kelangsungan hidup Ulva dan bakteri mutualistiknya pada 14 agen selektif dan menetapkan bahwa Blasticidin deaminase (BSD atau bsr) dapat digunakan sebagai penanda yang dapat dipilih untuk menghasilkan galur transgenik yang stabil. Kami menunjukkan bahwa Cas9 dan Cas12a RNP cocok untuk mutagenesis yang ditargetkan dan dapat menghasilkan penghapusan genom hingga 20 kb menggunakan gen penanda ADENINE PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE (APT). Kami menunjukkan bahwa penyisipan penanda yang dapat dipilih secara tertarget melalui perbaikan yang diarahkan oleh homologi atau penyuntingan bersama dengan APT dimungkinkan untuk gen nonpenanda. Kami mengevaluasi 31 konfigurasi vektor dan menemukan bahwa fusi bikistronik Cas9 ke penanda resistensi atau penggabungan intron dalam Cas9 menghasilkan mutan terbanyak. Kami menggunakan ini untuk menghasilkan mutan dalam tiga gen nonpenanda menggunakan strategi penyuntingan bersama.
Perangkat molekuler yang diperluas ini sekarang memungkinkan kami untuk membuat mutan perolehan dan kehilangan fungsi secara andal; pengoptimalan tambahan akan diperlukan untuk memungkinkan penyuntingan genom multipleks berbasis vektor di Ulva.
Leave a Reply